大腸桿菌 宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒用於大腸桿菌的定量分析 各類生物製品的中間樣本、半成品、成品中宿主細胞DNA殘留。

本試劑盒採用Taqman螢光探針及聚合酶鍊式反應（PCR）方法，具有fg級最低檢測限，可特異且快速地檢測出殘留的大腸桿菌 細胞 DNA。此試劑盒需與殘留DNA樣本製備試劑盒（Cat#18461ES）一起使用。

驗證報告

規格

成分

貯存

本產品儲存於-25~-15℃，保質期為2年。

41308-A 和 41308-B 均應避光保存。

適用儀器型號

包括但不限於：

Bio-Rad：CFX96 光學模組。

賽默飛世爾科技：ABI 7500； ABI Quant Studio 5。

指示

1. 大腸桿菌。 DNA標準稀釋及標準曲線製作

大腸桿菌 使用試劑盒中提供的 DNA 稀釋緩衝液對 DNA 對照組進行梯度稀釋^*以及稀釋

濃度為300pg/μL、30pg/μL、3pg/μL、300fg/μL、30fg/μL。

請參閱下面的詳細說明：

• 在冰上解凍 coliDNA 對照和 DNA 稀釋緩衝液。完全解凍後，輕輕渦旋混勻，以低速離心 10 秒。
• 取出六個乾淨的 1.5 mL 管，標記為 Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5。
• 將90 μL DNA稀釋緩衝液和10 μL coliDNA Control加入到標記為Std0的1.5 mL微量離心管中，即 稀釋至 3 ng/μL。混合後離心 10 秒鐘。將稀釋後的DNA標準品分裝，可在-25~-15℃短期保存（不超過3個月）^**.請避免反覆凍融。
• 將 90 μL DNA 稀釋緩衝液加入其他管中^***，然後按照以下步驟進行連續稀釋^****。

表1 標準梯度稀釋

^*每個濃度需要三個重複孔。 fg/μL~300pg/μL且範圍可擴展。

^**為了減少重複凍融次數及避免污染，建議首次將DNA對照分裝於-25~-15℃保存。

^***DNA稀釋緩衝液解凍後可在2-8°C保存7天，若長期不使用，請保存於-25~-15℃。

^****確保模板完全混合，每個梯度稀釋時輕輕搖晃混合物 15 秒至 1 分鐘。

2. 提取回收控制 (ERC) 準備

依需求設定ERC中E.coli DNA的濃度（ERC樣品製備30 pg E.coli DNA為例），如下：

• 取100 μL檢測樣本於一個乾淨的1.5 mL管中，加入10 μL 3pg/μL E.coli DNA Standard（Std3），混勻，標記為ERC。
• 將ERC樣本的DNA萃取與測試樣本一起進行，製備純化的ERC樣本。

3. 陰性對照溶液 (NCS) 製備

實驗中設定陰性對照，具體操作步驟如下：

1) 將100 μL樣品基質（或DNA稀釋緩衝液）加入一個乾淨的1.5 mL管中，然後標記為NCS。

2) 將NCS樣本的DNA萃取與檢測樣本同時進行，製備純化的NCS樣本。

4. 無模板對照 (NTC) 製備

實驗中設置無模板對照，具體操作步驟如下：

1) NTC不需要樣本預處理，可以在qPCR檢測殘留DNA的階段進行配置。

2) 每個管或孔中的NTC樣本為20 μL Mix（即15 μL E.coli qPCR Mix + 5 μL E.coli Primer&probe Mix）+ 10 μL DNA Dilution Buffer。建議配置三個重複孔。

5. PCR反應體系

表2 反應體系

^*根據反應次數計算PCR反應總體積：qPCR Mix=（反應次數+2）×（15+5）μL（包含兩個反應孔的損失）。建議實驗中每個樣品重複三次以上。

^**蓋上管蓋或封上板後，將反應管或板以低速離心 10 秒鐘。充分搖晃和混合 5 秒鐘後，重複離心，以收集從蓋子或壁到底部的液體。操作過程中避免產生氣泡。

請參閱下表以了解建議的板材設定：

表3 電腦上參考板

板佈局包括：5個Std（5個標準濃度的標準曲線），1個NTC（無模板對照），1個NCS（陰性對照溶液），3個TS（測試樣品），3個ERC（提取回收對照）。每個樣品設三個重複孔。

6. 設定 PCR 儀器指南（2步法）（例如。 Thermo ABI 7500 qPCR儀（Version 2.0軟體）

以下說明僅適用於 Thermo ABI 7500 qPCR 儀器（軟體版本 2.0）。如果您使用不同的儀器，請參閱適用的儀器指南以取得設定指南。

1） 產生新實驗，選擇絕對定量或使用者定義的模板。

2） 創建1個檢測探針，命名為“E.coli-DNA”，選擇報告螢光團為“FAM”，淬滅螢光團為“None”。參考螢光為「ROX」（參考螢光可依儀器型號等選擇是否需要添加）。

3） 在‘樣本’窗格中，依序新增所有樣本資訊。然後選擇孔，相應地選擇目標和樣本。設定大腸桿菌的任務 以DNA標準品為標準品，在Quantity欄中分別賦值300000、30000、3000、300、30（每孔DNA濃度單位為fg/μL），各孔命名為Std 1、標準 2、標準 3、標準 4、標準 5，相應地。設定NTC的任務為NTC。設定 NCS、TS 和 ERC 為未知，並根據上面的板塊佈局進行相應命名。然後點擊下一步。

4） 設定擴增程序：設定反應體積為30 μL。

表4 擴增步驟

7. qPCR 結果分析

1） 系統會在分析的擴增圖面板中自動給出閾值。有時系統給出的Threshold太接近基線，導致重複孔之間的Ct差異很大。您可以手動調整閾值到合適的位置，然後按一下分析。然後可以在Multicomponent Plot中初步檢查擴增曲線是否正常。

2） 在「結果分析」標籤中，查看標準曲線圖。驗證 R 的值²、效率、坡度 和 Y 截距。對於常態標準曲線，R²>0.99， 90%≤效率%≤110%，-3.6≤斜率≤-3.1。

3） 在分析中的「檢視孔表」窗格中，每個樣本的濃度以數量顯示，單位為 fg/μL，可在檢測報告中轉換單位。

4）結果分析的參數設定需要根據特定機型和使用的軟體版本而定，一般可以由儀器自動解讀。

5)根據待測樣品TS測試結果及樣品加標回收率ERC計算加標回收率，要求加標回收率在50%~150%之間。加標回收率測定公式：回收率（%）= {Sample spiked assay (eg.pg/μL) - Sample assay (eg.pg/μL)} x 洗脫體積(μL) / DNA加入量理論值(eg.pg) x 100%。

6)陰性對照NCS的Ct值應大於標準品最低濃度Ct的平均值。

• 無模板對照NTC應為未確定或Ct值≥3

筆記

1. 本產品僅供研究使用。
2. 為了您的安全，請穿著實驗服和戴上一次性手套進行操作。

3.使用該試劑前請仔細閱讀本說明書，實驗應標準化，包括樣品處理、反應體系製備、樣品的添加等。

4.使用前確保各組分充分渦旋並以低速離心。

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