使用複製型慢病毒 (RCL) 檢測試劑盒 定量檢測複製慢病毒 可能發生在 與慢病毒相關的多種細胞產品 矢量的潛在風險。

該試劑盒設計了特定的引子 慢病毒包膜蛋白的VSV-G基因序列。 它採用taqman  螢光探針和聚合酶鍊式反應（PCR）方法，其檢測極限為1拷貝/μL級， 可以特異性、快速地檢測 具有複製能力的慢病毒風險。該套件需要 一起使用 殘留 DNA 樣本製備試劑盒（Cat# 18461ES）。

成分

* 我知道了： 內部的 控制。

貯存

本產品應儲存於-25~-15℃ 2 人份 年。

41311-A 和 41311-B 均應避光保存。

適用的 樂器 模型

包括但不限於： Bio-Rad：CFX96 光學模組；熱電科技： ABI 7500； ABI Quant Studio 5； ABI 步驟 OnePlus。

指示

1. 克隆的DNA 標準 稀釋 和 標準 曲線 準備

使用試劑盒中提供的 DNA 稀釋緩衝液對 RCL DNA 對照進行梯度稀釋* 以及稀釋 濃度為5×10E7 拷貝/μL，5×10E6 拷貝/μL，5×10E5 拷貝/μL，5×10E4 拷貝/μL，5×10E3 拷貝/μL，5×10E2 拷貝/μL， 5×10E1 份/μL。

請參閱下面的詳細說明：

1） 在冰上解凍 RCL DNA 對照和 DNA 稀釋緩衝液。 完全解凍後， 輕輕旋渦 混合，然後 低速離心 10 秒鐘。

2） 取出七隻乾淨的 1.5 mL 管，標示為 Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5、Std6。

3） 添加 90 μL DNA 稀釋緩衝液和 10 將 μL RCL DNA 對照加入標示 Std0 的 1.5 mL 微量離心管中， 即   稀釋至 5×10E7 份/μL。混合並 然後離心 10 秒鐘。分裝稀釋的DNA標準品，即可 短期儲存（不超過3個月）於-25~-15℃** .請避免反覆凍融。

4） 添加 90 μL DNA 稀釋緩衝液倒入其他管中*** ，然後按照以下步驟操作 連續稀釋**** 。

表1 標準梯度稀釋

*三 複製 井 是 必需的 為了 每個 濃度 偵測 範圍 是 5×10E1 拷貝/μL~5×10E6 份/微升 和 這 範圍 能 是 如果需要的話可以擴充。

** 到 減少 這 數位 的 重複 凍融 和 避免 污染，它 是 受到推崇的 到 店鋪 這 脫氧核糖核酸 控制 在 等分試樣 在 -25~-15℃ 為了 這 第一的 時間。

*** 一次 解凍， 脫氧核糖核酸 稀釋 緩衝 可以 是 儲存 在 2-8℃ 為了 7 天，如果 不是 用過的 為了 一個 長的 請給時間 店鋪 在 -25~-15℃ 。

**** 製作 當然 這 範本 是 完全地 混合，輕輕地 搖 這 混合物 為了 15 秒 到 1 分鐘 為了 每個 坡度 稀釋。

2. 萃取回收 控制 （環境責任委員會） 準備

根據需要設定 ERC 中 RCL DNA 的濃度（ERC 樣品以 5×10E4 將 RCL DNA 複製為 舉例來說），如下：

1） 新增 100 μL 測試樣品放入乾淨的 1.5 mL 管中，然後加入 10 微升 5×10E3 拷貝/μL RCL DNA 標準 (Std4) 和 混合均勻，標記為ERC。

2） 將ERC樣本的DNA萃取與測試樣本一起進行，製備純化的ERC樣本。

3. 陰性對照 解決方案 （國家癌症中心） 準備

實驗中設定陰性對照，具體操作步驟如下：

1） 新增 100 μL 樣本基質（或 DNA 稀釋緩衝液）倒入乾淨的 1.5 mL 管中，然後標記為 NCS。

2) 進行 NCS 的 DNA 萃取 樣品與測試樣品一起製備純化的NCS 樣本。

4. 無模板 控制 （NTC） 準備

實驗中設置無模板對照，具體操作步驟如下：

1）NTC無需樣品預處理，可在qPCR檢測殘留DNA的階段進行配置 內容。

2）每管或每孔中NTC樣品20 μL 混合液（即 15 μL RCL qPCR 混合物 + 4 微升 雷諾公司 引子和探針 混合 + 1 μL IC）+ 10 μL DNA稀釋緩衝液。建議配置三個重複孔。

5. 聚合酶連鎖反應 反應 系統

表2 反應體系

* 計算 這 全部的 聚合酶連鎖反應 反應 體積 經過 這 數位 的 反應：qPCR 混合 =（ 數位 的 反應+2） × (15+4+1) μL（含 這 損失 兩個反應孔）。建議實驗中每個樣品重複三次以上。

** 後 封蓋 這 管子 或者 密封 這 板、離心機 這 反應 管子 或者 盤子 在 低的 速度 為了 10秒。後 充足的 搖晃 和 混合 為了 5秒，重複 離心機 到 收集 這 液體 從 這 蓋 或者 牆 到 這 底部。避免 氣泡 期間 手術。

請參閱下表以了解建議的板材設定：

表3 計算機開機 參考 木板

板佈局包括：6 個 Std（6 個標準濃度的標準曲線）、1 個 NTC（無模板對照）、1 NCS（陰性對照溶液）、3TS（測試樣本）、3ERC（萃取回收對照）。三個重複孔 每個樣本。

6. 設定指南 為了 一個 聚合酶連鎖反應 樂器

以下說明僅適用於 熱 ABI 7500 qPCR 儀器（軟體 版本2.0）。如果 你使用 不同的儀器，請參閱適用的儀器指南以了解設定指南。

1）產生新實驗，選擇絕對定量模板或 用戶定義。

2) 創建1個檢測探針，命名為“RCL-DNA”，選擇報告螢光團為“FAM”，淬滅螢光團為 “沒有任何”;建立 1 個檢測探針，命名為“IC”，選擇報告螢光團為“CY5”，然後淬滅 螢光團為「無」。 參考螢光為ROX」（參考螢光可以基於 儀器型號等，選擇 無論 您需要添加它）。

3）在 ‘Samples’窗格，依序加入所有samples的資訊。然後選擇孔，選擇目標， 樣品。放 RCL DNA標準的任務作為標準，並分配 值 5000000, 500000, 在 Quantity 欄中分別輸入 50000、5000、500、50（每孔 DNA 濃度單位為拷貝數/μL），並將  分別為孔 Std 1、Std 2、Std 3、Std 4、Std 5 和 Std 6。設定 NTC 作為 NTC 的任務。將 NCS、TS 和 ERC 設定為 未知，並根據上面的板塊佈局相應命名。 然後點擊下一步。

4)設定擴增程序：設定反應體積為30 μL。

表4 擴增程序

7. 分析 定量PCR 結果

1）系統 將自動給出閾值 擴增圖面板 分析。給定的閾值 系統有時過於接近基線，導致差異很大 重複孔之間的 Ct。 您可以手動調整 將閾值調整到適當位置並點擊 分析。然後你可以初步檢查 多組分圖中擴增曲線是否正常。

2）結果 分析選項卡，查看標準曲線圖。 驗證 R2、效率、斜率和 Y 截距。對於常態標準曲線，R²>0.99，90%≤Eff%≤110%，-3.6≤Slope≤-3.1。

3）在 '看法 好表'窗格中 分析，每個樣品的濃度以數量表示， 單位 為拷貝數/μL，單位可在檢測報告中換算。

4）參數設定 結果分析需要基於具體的模型和軟體 版本 並且通常可以由儀器自動解釋。

5) 根據測試結果計算加標回收率 樣本 TS 待測量和樣品加標 回收率 ERC 需要尖刺 介於50%~150%之間。

回收率 (%) = {Sample spiked assay (eg.copies/μL) - Sample assay (eg.copies/μL)} x 洗脫體積 (μL) / 理論 DNA添加量值（例如拷貝數） x 100%。

6）CT 的價值 陰性對照 NCS 應該大於平均值 最低濃度 Ct 這 標準。

7） 免模板控制NTC 應為未確定或 Ct 值≥38。

筆記

1. 本產品僅供研究使用。
2. 為了您的安全，請穿著實驗服和戴上一次性手套進行操作。

3.使用前請仔細閱讀本手冊 該試劑和實驗應標準化，包括 樣品處理、反應體系製備和 樣品添加。

4.使用前確保各組分充分渦旋並以低速離心。

手動的