1 مبدأ عمل الجينوميسين

الجينوميسين (Geneticin, G418) هو مضاد حيوي أمينوغليكوزيدي يثبط تخليق البروتين عن طريق منع امتداد سلسلة الببتيد عن طريق الارتباط بالريبوسومات 70S و80S في الخلايا البدائية والحقيقية النواة. هذه الآلية سامة للخلايا بما في ذلك البكتيريا والخميرة والنباتات والثدييات. عندما يتم تحويل الخلايا بنجاح ودمجها مع جين مقاومة النيومايسين (مثل جين neo)، يمكن أن تعدل فوسفوترانسفيراز الأمينوغليكوزيد المشفر بالجين (APH (3) II) تساهميًا G418 لتعطيله، وبالتالي منح المقاومة للخلايا المزروعة في وسط انتقائي يحتوي على G418.

في الاختبارات الجينية الجزيئية، يعد G418 أحد الاختبارات الشائعة الاستخدام للانتقال المستقر.

2 تطبيق الجينوميسين

2.1 فحص خطوط الخلايا المستقرة المحولة وراثيا

• تم استخدام G418 لفحص الخلايا التي تحتوي على جينات مقاومة (على سبيل المثال، جينات نيو) عن طريق تثبيط تخليق البروتين. تعمل فوسفوترانسفيراز الأمينوغليكوزيد المشفر بواسطة جين المقاومة على تعطيل G418، مما يمنح الخلايا مقاومة لـ G418. عادةً، يتراوح نطاق فحص الخلايا الثديية بين 200 و2000 ميكروجرام/مل، مع التركيز العامل الأكثر استخدامًا بين 100 و700 ميكروجرام/مل. عندما تكون الخلايا النباتية 10-100 ميكروجرام/مل وخلايا الخميرة 500-1000 ميكروجرام/مل، فيما يلي التركيزات المستخدمة لبعض أنواع الخلايا باستخدام G418 كمرجع.

خلية	طلب	تركيز تنشيط الجينوميسين (ميكروجرام/مل)	الأعمال المذكورة
أنواع الميكوكور	أ) المزروعة في وسط النمو ب) المزروعة على البكتيريا المجففة بالتجميد	أ) 10 ميكروجرام/مل ب) 30 ميكروجرام/مل	هيرث، وآخرون، الإجراءات الأكاديمية الوطنية للعلوم المجلد 79، 7356-7360 (1982).
الثدييات	أ) للفحص ب) للحفاظ على النمو	أ) 400-1000 ميكروجرام/مل ب) 200 ميكروجرام/مل	الكنعاني وبيرج، الإجراءات الأكاديمية الوطنية للعلوم المجلد 79، 5166-5170 (1982).
نبات	أ) للفحص ب) للحفاظ على النمو	أ) 25-50 ميكروجرام/مل ب) 10 ميكروجرام/مل	أورسيك، وآخرون، الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية والبحوث المشتركة المجلد 101:3، 1031-1037 (1981).
خميرة	أ) للفحص ب) للحفاظ على النمو	أ) 500 ميكروجرام/مل ب) 125-200 ميكروجرام/مل	جيمينيز وديفيز، طبيعة، المجلد 287، 869-871 (1980).
البكتيريا	للفحص	16 ميكروجرام/مل	وايتز، وآخرون، العوامل الكيميائية المضادة للميكروبات المجلد 6: 5، 579-581 (1974).

2.2 إخراج الجينات ونقل الجينات

• في عملية إخراج الجينات، يمكن استخدام G418 لفحص الخلايا التي نجحت في إخراج الجين المستهدف. وفي عملية نقل الجينات، يسهل G418 دمج الجينات الغريبة في جينوم الخلايا المضيفة.

2.3 اختيار المقاومة في زراعة الخلايا

• أثناء زراعة الخلايا، يتم استخدام G418 للبحث عن الخلايا المقاومة للمضاد الحيوي، والتي غالبًا ما تحمل جينات مقاومة محددة.

3 إجراءات تجريبية ذات صلة بالجينوميسين

3.1 تحضير محلول المخزون G418 (50 مجم/مل، التركيز النشط)

1) تحويل وحدات النشاط

قم بالتحويل باستخدام الصيغة: (1000/A0) × A1 = A2، حيث A0 هي قوة G418، والتي تختلف باختلاف الدفعة. راجع تقرير مراقبة الجودة للدفعة المقابلة أو الملصق الموجود على الزجاجة. A1 هو التركيز النشط المطلوب لـ G418 المراد تحضيره. A2 هو تركيز المسحوق الفعلي إلى الحجم المراد وزنه.

على سبيل المثال، إذا كانت دفعة G418 لها قوة 750 وحدة/ملجم وترغب في تحضير تركيز نشط يبلغ 50 ملجم/مل، فإن تركيز المسحوق الفعلي الذي يجب تحضيره هو 1000/750 × 50 ملجم/مل = 66.67 ملجم/مل.

في حالة تحضير 10 مل من محلول G418 (التركيز النشط، 50 ملغ/مل)، فإن الكمية المطلوبة هي 666.7 ملغ من المسحوق.

• التعقيم والتخزين

بناءً على وزن المسحوق الفعلي الذي تم الحصول عليه من التحويل أعلاه، أضفه إلى 10 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم ليذوب تمامًا.

أولاً، قم بترطيب فلتر حقنة 0.22 ميكرومتر مسبقًا بـ 5 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم، مع إزالة كل الماء. ثم قم بالتصفية باستخدام هذا الفلتر للتعقيم وقسمه إلى أجزاء صغيرة للاستخدام مرة واحدة (على سبيل المثال، 1 مل) وقم بتخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة عام واحد.

3.2 إنشاء منحنى القتل

1) اليوم الأول: ضع الخلايا غير المحولة في أطباق بكثافة خلايا 20-25% في أطباق الثقافة المناسبة واحتضنها طوال الليل عند 37 درجة مئوية وCO2.₂.

2) قم بتعيين تدرج التركيز ضمن نطاق مناسب بناءً على نوع الخلية، واختيار 6 تركيزات على الأقل (G418 هو الأكثر نشاطًا ضد الخلايا في مرحلة الانقسام، لذلك يجب زراعة الخلايا لفترة قبل إضافة G418)، على سبيل المثال، بالنسبة للخلايا الثديية، قم بتعيين 0، 50، 100، 200، 400، 800، 1000 ميكروغرام/مل.

3) اليوم الثاني: إزالة وسط الثقافة القديم واستبداله بوسط جديد محضر يحتوي على التركيز المقابل من الدواء، مع ثلاث مكررات لكل تركيز.

4) استبدالها بوسط جديد يحتوي على الدواء كل 3-4 أيام.

5) قم بإجراء تعداد للخلايا الحية على فترات زمنية ثابتة (على سبيل المثال، كل يومين) لتحديد التركيز المناسب الذي يمنع نمو الخلايا غير المحولة. حدد أقل تركيز يمكنه قتل غالبية الخلايا في غضون العدد المثالي من الأيام (عادةً 7-10 أيام) باعتباره التركيز العامل لفحص سلالة الخلايا المحولة المستقرة.

3.3 فحص الخلايا المستقرة المحولة وراثيا

• يتميز منتج G418 Geneticin (60220ES) الذي تقدمه شركة Yisheng Biotech بفعالية ≥720 وحدة/ملجم، ونقاء يبلغ حوالي 98%، واستقرار الدفعة، وسعر يقارب ثلث سعر منتجات G418 التي تنتجها الشركات الأخرى.
• تم استبدال وسط الفحص المحتوي على الأدوية كل 3-4 أيام.
• تم ملاحظة وتقييم تكوين مستنسخات الخلايا (المستعمرات) بعد 7 أيام من الاختيار. قد يستغرق تكوين المستعمرات أسبوعًا أو أكثر، اعتمادًا على نوع الخلية المضيفة، والتحويل الجيني، وفعالية الفحص.
• تم اختيار 5-10 استنساخات مقاومة ونقلها إلى أطباق زراعة الخلايا مقاس 35 مم وتم الحفاظ عليها باستخدام وسط فحص يحتوي على الدواء لمدة 7 أيام.
• بعد تغيير الثقافة المتوسطة العادية.

4 توصية المنتج

جيناتيسين G418 (60220ES) مقدمة من Yeasen تتمتع شركة Biotech بفعالية ≥720 وحدة/ملجم، ونقاء بنسبة ~98%، واستقرار للدفعة، وسعر يقارب ثلث سعر منتجات G418 التي تنتجها الشركات الأخرى.

مواصفة	س*	ت*	ياسين	ميزة ييسن
المحتوى (HPLC)	/	/	~98%	نقاء عالي
الفعالية (وحدة/ملجم)	≥720 ميكروغرام/ملغ	707-721 ميكروجرام/ملجم	≥720 ميكروغرام/ملغ	فعالية عالية
السعر (5 جرام)	~1000	~1000	~200	رخص

5 حالة تجريبية

في E. coli، كانت G69 و G99 عبارة عن دفعتين مختلفتين؛ كانت تركيزات الجينوميسين 8 ملغ / لتر، 12 ملغ / لتر و 16 ملغ / لتر، على التوالي، وكان الحد الأدنى للتركيز الفعال 16 ملغ / لتر، مما منع نمو البكتيريا المتنوعة تمامًا.