1 أمبدأ العمل
هيجروميسين ب هو مضاد حيوي أمينوغليكوزيد يتم إنتاجه عن طريق استقلاب Streptomyces hygroscopicus، والذي يثبط تخليق البروتين عن طريق تعطيل النقل وتعزيز القراءة الخاطئة للريبوسومات 80S، وبالتالي قتل الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة.
في الوقت الحاضر، يتم استخدامه بشكل شائع لفحص وصيانة الخلايا بدائية النواة أو حقيقية النواة التي تحتوي على جين مقاومة الهيجرومايسين.
2 تطبيق
2.1 فحص وصيانة ثقافة الخلايا البدائية أو حقيقية النواة (الخلايا النباتية والخلايا الثديية) المحولة بشكل مستقر باستخدام Hph+متجهاتالهيجرومايسين ب جين مقاومة الهيجرومايسين (hyg أو hph) المشتق من الإشريكية القولونية يشفر فوسفوترانسفيراز الهيجرومايسين ب، والذي يحول الهيجرومايسين ب إلى منتج فسفوري غير نشط بيولوجيًا، وبالتالي إزالة السموم. في ضوء هذا المبدأ، يعد الهيجرومايسين ب علامة اختيارية مفيدة للغاية لفحص وصيانة الخلايا البدائية أو حقيقية النواة المزروعة المحولة بنجاح باستخدام جين مقاومة الهيجرومايسين.
2.2 نظرًا للاختلاف في طريقة العمل، غالبًا ما يتم استخدام الهيجرومايسين ب بالاشتراك مع الجينيتين G418 والبليوميسين والبلاستيسيدين لفحص خطوط الخلايا المحولة بشكل مستقر باستخدام ناقلين مختلفين.لدى هيجروميسين ب طريقة عمل مختلفة عن G418 (رقم الصنف 60220ES)، بليومايسين (رقم الصنف 60257ES) والبلاستيسيدينات (Cat#60218ES)، لذلك فهي مناسبة للاستخدام مع المضادات الحيوية الانتقائية الأخرى في تجارب الاختيار المزدوج.
2.3 عامل مضاد للفيروسات2.4 يتم إضافته إلى علف الحيوانات كمضاد للديدان، ويتم تربيته.
2.5 فحص الخلايا المحولة بشكل مستقر
يختلف تركيز هيجروميسين ب المستخدم في فحص الخلايا المستقرة المحولة وراثيًا حسب نوع الخلية والوسط وظروف النمو ومعدل التمثيل الغذائي للخلية. التركيز الموصى به هو 50-1000 ميكروجرام/مل. بالنسبة للاستخدام الأول للنظام التجريبي، يوصى بتحديد تركيز الفحص الأمثل من خلال إنشاء منحنى قتل، أي منحنى استجابة الجرعة. بشكل عام، 50-500 ميكروجرام/مل للخلايا الثديية؛ 20-200 ميكروجرام/مل للخلايا البكتيرية/النباتية؛ 200-1000 ميكروجرام/مل للفطريات.
3 بروتوكول
3.1 تحضير محلول التخزين (50 ملغ/مل)
قم بوزن 0.5 جرام من هيجروميسين ب وأضف 10 مل من 1×PBS، درجة حموضة 7.4. بعد الذوبان الكامل، قم بالترشيح باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر للتعقيم. قسّم المحلول المعقم إلى أجزاء وخزنه في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
3.2 تركيز الفحص المستخدم بشكل شائع
يختلف تركيز هيجروميسين ب المستخدم في فحص السلالات المستقرة وفقًا لنوع الخلية ووسط الثقافة وظروف النمو ومعدل التمثيل الغذائي للخلية. يوصى بإنشاء منحنى قتل (منحنى استجابة الجرعة) لتحديد تركيز الفحص الأمثل لأول مرة. بشكل عام، الخلايا الثديية: 50-500 ميكروجرام/مل؛ الخلايا البكتيرية/النباتية: 20-200 ميكروجرام/مل؛ الفطريات: 300-1000 ميكروجرام/مل.
3.3 إنشاء منحنى القتل
【ملاحظة】من أجل فحص خطوط الخلايا المستقرة، من الضروري تحديد الحد الأدنى لتركيز المضادات الحيوية القادرة على قتل الخلايا المضيفة غير المحولة. ويمكن تحقيق ذلك من خلال إنشاء منحنى قتل (منحنى الاستجابة للجرعة). يجب ترتيب خمسة تركيزات على الأقل.
1) اليوم الأول: يتم وضع الخلايا غير المحولة في لوحة ثقافية مناسبة بكثافة خلوية تتراوح بين 20-25% ويتم زراعتها طوال الليل.【ملاحظة】يمكن زيادة كمية خلايا التطعيم للخلايا التي تتطلب كثافة أعلى للكشف عن الحيوية.
2) اضبط تدرج التركيز ضمن النطاق المناسب وفقًا لنوع الخلية. يمكن لخلية الثدييات ضبط 50، 100، 250، 500، 750، 1000 ميكروجرام/مل. قم بتخفيف محلول هيجروميسين ب بنسبة 1:10 باستخدام الماء منزوع الأيونات أو محلول PBS إلى 5 مجم/مل. ثم قم بتخفيف المحلول إلى التركيز العامل المقابل وفقًا للجدول التالي.
| التركيز النهائي (ميكروجرام/مل) | الحجم المتوسط (مل) | حجم الإضافة لـ 5 ملغ/مل هيجروميسين ب (مل) |
| 50 | 9.9 | 0.1 |
| 100 | 9.8 | 0.2 |
| 250 | 9.5 | 0.5 |
| 500 | 9.0 | 1.0 |
| 750 | 8.5 | 1.5 |
| 1000 | 8.0 | 2.0 |
3) اليوم الثاني: استبدل الوسط المحضر حديثًا والذي يحتوي على التركيز المقابل للدواء. قم بعمل ثلاث عينات متوازية لكل تركيز.
4) قم باستبدال الوسائط الجديدة التي تحتوي على الأدوية كل 3-4 أيام.
5) يتم إجراء تعداد الخلايا الحية في دورة ثابتة (على سبيل المثال، كل يومين) لتحديد التركيز المناسب لمنع نمو الخلايا غير المحولة. اختر الحد الأدنى للتركيز الذي يقتل غالبية الخلايا في غضون عدد مثالي من الأيام (عادةً 7-10 أيام)، باعتباره التركيز العامل لفحص سلالة الخلايا المستقرة.
3.4 فحص الخلايا المستقرة المحولة
1) بعد 48 ساعة من التحويل الجيني، تمت إعادة زراعة الخلايا باستخدام وسط فحص يحتوي على هيجروميسين ب بتركيز مناسب (مباشر أو مخفف). 【ملاحظة】تعمل المضادات الحيوية بشكل أفضل على الخلايا المنقسمة بنشاط. إذا كانت الخلايا كثيفة للغاية، فلن يقتل المضاد الحيوي الخلايا. قم بتقسيم الخلايا بحيث لا تزيد نسبة التقاء الخلايا عن 25%.
2) قم بتغيير وسط الفحص كل 3-4 أيام.
3) قم بقياس تكوين مستعمرة الخلايا بعد 7 أيام من الفحص. قد يستغرق تكوين المستعمرة أسبوعًا آخر أو أكثر، اعتمادًا على نوع الخلية المضيفة، والتحويل الجيني، وفعالية الفحص.
4) اختيار 5-10 استنساخات مقاومة ونقلها إلى أطباق زراعة الخلايا مقاس 35 مم، وزراعتها في وسط فحص يحتوي على الدواء لمدة 7 أيام.
5) استبدالها بوسط جديد بدون أدوية للثقافة.
4 خصائص
هيجروميسين ب هو مسحوق أبيض إلى بني مصفر ذو رائحة خاصة، يذوب بسهولة في الماء والميثانول والإيثانول وما إلى ذلك، ويشكل بسهولة الأملاح مع العديد من الأحماض العضوية وغير العضوية.
5 تخزين المنتج
يمكن تخزين المحلول مباشرة عند درجة حرارة تتراوح من 2 إلى 8 درجات مئوية ويمكن تخزينه لأكثر من 6 أشهر.
6 الحذر
1) الخلايا المحولة بجين hph مقاومة للهيجرومايسين، وتعبر الخلايا المحولة عن الجين بشكل ثابت أو مؤقت.
2) تم العثور على جين مقاومة الهيجرومايسين ب (hyg أو hph) في سلالات أخرى، بما في ذلك Streptomyces hygroscopicus و Klebsiella pneumoniae، بالإضافة إلى E. Coli.
7 توصيات المنتج
ياسين يوفر هيجروميسين ب في شكلين، مسحوق (1 جم / 10 جم، رقم القطة 60225ES) ومحلول (50 ملغ / مل، رقم القطة 60224ES).
| اسم المنتج | قطة# | مواصفة |
| هيجروميسين ب (50 ملغ/مل) | 60224ES03 | 1 جرام (20 مل) |
| 60224ES10 | 10×1 جم (20 مل) | |
| هيجروميسين ب | 60225ES03 | 1 جرام |
| 60225ES10 | 10 جرام |
8 مقالات منشورة باستخدام كواشفنا
[1] Zhao Q، Zheng K، Ma C، وآخرون. PTPS يسهل النترتة S-LTBP1 المقسمة ويعزز نمو الورم تحت نقص الأكسجين. خلية مولية . 2020;77(1):95-107.e5. دوى:10.1016/ي .molcel.2019.09.018 (إذا:14.548)
[2] Wu LY، Shang GD، Wang FX، وآخرون. يكشف ملف تعريف حالة الكروماتين الديناميكي عن الأدوار التنظيمية للأوكسين والسيتوكينين في تجديد البراعم. خلية التطوير . 2022;57(4):526-542.e7. دوى:10.1016/ j.devcel.2021.12.019 (إذا: 12.270)
[3] Zhang TQ، Chen Y، Wang JW. تحليل خلية واحدة لقمة البراعم الخضرية لنبات أرابيدوبسيس. خلية التطوير . 2021;56(7):1056-1074. e8. دوى:10.1016/j.devcel.2021.02.021 (إذا: 12.270)
[4] Wang FX، Shang GD، Wu LY، Xu ZG، Zhao XY، Wang JW. ديناميكيات إمكانية الوصول إلى الكروماتين وبنية الشبكة التنظيمية النسخية الهرمية لتكوين الأجنة الجسدية النباتية. خلية التطوير . 2020;54(6):742-757.e8. دوى:10.1016/j.devcel.2020.07.003 (إذا:10.092)
[5] Zhu GD, Yu J, Sun ZY, et al. فحص CRISPR/Cas9 على مستوى الجينوم يحدد CARHSP1 المسؤول عن مقاومة الإشعاع في الورم الأرومي الدبقي. مرض موت الخلية . 2021؛12(8):724. نُشر في 21 يوليو 2021. doi:10.1038/s41419-021-04000-3 (إذا: 8.469)
[6] Chen J، Huang Y، Tang Z، وآخرون. فحص تنشيط النسخ CRISPR-Cas9 على مستوى الجينوم في جين سرطان البروستاتا المرتبط بمقاومة الميتفورمين. تطوير الخلية الأمامية . 2021؛8:616332. نُشر في 26 يناير 2021. doi:10.3389/fcell.2020.616332 (إذا:6.684)
[7] Jiang Z، Cui Z، Zhu Z، وآخرون. هندسة ناقلات Yarrowia lipolytica لإنتاج حمض السكسينيك الحيوي عالي الكفاءة من الجلوكوز. التكنولوجيا الحيوية الوقود الحيوي . 2021؛14(1):145. نُشر في 27 يونيو 2021. doi:10.1186/s13068-021-01996-w (إذا: 6.040)
[8] Liu Y، Jiang X، Cui Z، Wang Z، Qi Q، Hou J. هندسة الخميرة الزيتية Yarrowia lipolytica لإنتاج α-farnesene. التكنولوجيا الحيوية الوقود الحيوي . 2019؛12:296. نُشر في 23 ديسمبر 2019. doi:10.1186/s13068-019-1636-z (إذا:5.452)
[9] Zhou C وZeng Z وSuo J وآخرون. التلاعب بعامل النسخ المفرد Ant1 يعزز تراكم الأنثوسيانين في حبوب الشعير. مجلة الكيمياء الزراعية والغذائية . 2021؛69(18):5306-5317. doi:10.1021/acs.jafc.0c08147 (إذا:5.279)
[10] كوي زي، زينج إتش، جيانغ زي، وآخرون.تحديد وتوصيف أصل تكرار الميتوكوندريا للتعبير المستقر والجزئي في نبات Yarrowia lipolytica. ACS Synth Biol . 2021؛10(4):826-835. doi:10.1021 /acssynbio.0c00619 (إذا:5.110)
9 منتجات ذات صلة
| اسم المنتج | قطة# | مواصفة |
| سيبروفلوكساسين هيدروكلوريد | 60201ES05/25/60 | 5/25/100 جرام |
| أمبيسيلين، ملح الصوديوم | 60203ES10/60 | 10/100 جرام |
| هيكلات الدوكسيسيكلين | 60204ES03/08/25 | 1/5/25 جرام |
| كلورامفينيكول، درجة USP | 60205ES08/25/60 | 5/25/100 جرام |
| كبريتات كاناميسين | 60206ES10/60 | 10/100 جرام |
| تيتراسيكلين هيدروكلوريد تيتراسيكلين هيدروكلوريد (USP) | 60212ES25/60 | 25/100 جرام |
| فانكومايسين هيدروكلوريد | 60213ES60/80/90 | 100 ملغ/1 جرام/5 جرام |
| ملح كبريتات الجنتاميسين | 60214ES03/08/25 | 1/5/25 جرام |
| سبكتينوميسين هيدروكلوريد | 60215ES08 | 5 جرام |
| فليوميسين (20 ملغ/مل في المحلول) | 60217ES20/60 | 20/5×20مجم |
| بلاستيسيدين س (بلاستيسيدين) | 60218ES10/60 | 10/10×10مجم |
| نيستاتين | 60219ES08 | 5 جرام |
| كبريتات G418 (جينيتيسين) | 60220ES03/08 | 1/5 جرام |
| بوروميسين (محلول 10 ملغ/مل) | 60209ES10/50/60/76 | 1×1 /5 ×1 / 1 0 ×1 /50 ×1 مل |
| بيوروميسين ديهيدروكلوريد | 60210ES25/60/72/76/80 | 25/100/250/500 ملغ / 1 غرام |
| هيجروميسين ب (50 ملغ/مل) | 60224ES03 | 1 جرام (20 مل)/10×1 جرام (20 مل) |
| هيجروميسين ب | 60225ES03/10 | 1/10 جرام |
| إريثروميسين | 60228ES08/25 | 5/25 جرام |
| تيمنتين | 60230ES07/32 | 3.2/10×3.2 جرام |
| أوريوباسيدين أ (AbA) | 60231ES03/08/10 | 1/5×1/10×1مجم |
| كبريتات بوليميكسين ب | 60242ES03/10 | 1/10وحدة دولية |