يشير مصطلح موت الخلايا المبرمج بشكل عام إلى نوع من موت الخلايا المبرمج الذي يحدث من خلال تنظيم الجينات داخل الخلايا ومنتجاتها أثناء نمو الخلايا أو تحت تأثير بعض العوامل. يلعب موت الخلايا المبرمج دورًا مهمًا في نمو الجنين وتكوينه، واستقرار مجموعات الخلايا الطبيعية في الأنسجة، ودفاع الجسم واستجابته المناعية، وتلف الخلايا والشيخوخة الناجمة عن المرض أو التسمم، وحدوث الأورام وتطورها، وله أهمية علاجية محتملة.

تحدث الأحداث في المسار المبرمج للموت في تسلسل زمني، أي أن الأحداث تحدث في تسلسل، وتؤدي في النهاية إلى ظهور الأجسام المبرمجة للموت، مع حدوث موت الخلايا المبرمج.

خصائصها النموذجية هي كما يلي:

1. موت الخلايا المبرمج المبكر: تغيرات في بنية غشاء الخلية، انقلاب الفوسفاتيديل سيرين؛

2. المرحلة المبكرة والمتوسطة من موت الخلايا المبرمج: تزداد كثافة السيتوبلازم، ويختفي جهد غشاء الميتوكوندريا، وتتغير النفاذية، ويتم إطلاق السيتوكروم سي في السيتوبلازم؛

3. موت الخلايا المبرمج المتأخر: نقل إشارة موت الخلايا المبرمج؛

4. موت الخلايا المبرمج المتأخر: يتحلل الحمض النووي إلى حجم قطعة يتراوح بين 180 إلى 200 زوج قاعدي.

الشكل 1: حدوث واكتشاف الأحداث المتسلسلة في مسار موت الخلايا المبرمج

1. موت الخلايا المبرمج المبكر: Annexin-V/PI التلوين المزدوج (الكشف عن PS على الغشاء خارج الخلية)

في الخلايا الحية الطبيعية، يقع الفوسفاتيديل سيرين (PS) على الجانب الداخلي من غشاء الخلية. عندما يحدث موت الخلايا المبرمج، يتغير غشاء الخلية، وينتقل الفوسفاتيديل سيرين من السطح الداخلي لغشاء الخلية إلى السطح الخارجي لغشاء الخلية. Annexin-V هو بروتين مرتبط بالفوسفوليبيد يعتمد على Ca2+ بوزن جزيئي يتراوح بين 35 و36 كيلو دالتون، والذي يمكنه الارتباط بالفوسفاتيديل سيرين بألفة عالية. باستخدام Annexin-V المسمى بالفلوريسين (FITC، Alexa fluor488، إلخ) كمسبار، يمكن التعرف على الخلايا الميتة والخلايا الحية عن طريق قياس التدفق الخلوي أو المجهر الفلوري.

كما أن صبغة PS للخلايا الميتة سوف تنتقل من السطح الداخلي لغشاء الخلية إلى السطح الخارجي لغشاء الخلية. كما يمكن لـ Annexin-V التعرف على PS على سطح الخلايا الميتة، لذلك لا يمكن لـ Annexin-V التمييز بين الخلايا الميتة والخلايا الميتة. بالإضافة إلى ذلك، فإن يوديد البروبيدين (PI) عبارة عن صبغة حمض نووي، يمكنها الارتباط بالحمض النووي في الخلايا، ولا يمكنها اختراق الغشاء الخلوي الكامل. لا يزال الغشاء الخلوي للخلايا الميتة المبكرة والخلايا الحية سليمًا، ولا يمكن لصبغة PI دخول الخلية بحرية عبر الغشاء الخلوي للارتباط بالحمض النووي، لذلك لا يمكن لصبغة PI تسمية الخلايا الميتة والخلايا الحية، ولكن يمكن لصبغة PI الارتباط بالحمض النووي في الخلية من خلال الغشاء الخلوي للخلايا الميتة. ستصدر صبغة PI في الخلايا الميتة فلورسنت أحمر بعد إثارتها بواسطة ليزر 488 نانومتر، وسيتم استقبالها بواسطة القناة المقابلة. لذلك، يمكن استخدام Annexin V وPI معًا للتمييز بين الخلايا الحية والخلايا الميتة المبكرة والخلايا الميتة.

الشكل 2: تحليل نتائج قياس التدفق الخلوي بعد التلوين المزدوج لـ Annexin-v/pi

طلب المنتجات:

2. موت الخلايا المبرمج المبكر: تلطيخ JC-1 (الكشف عن التغيرات المحتملة في غشاء الميتوكوندريا)

غالبًا ما تكون عملية موت الخلايا المبرمج مصحوبة بتدمير الجهد الغشائي للميتوكوندريا، والذي يُعتبر على نطاق واسع أحد أقدم الأحداث في عملية سلسلة موت الخلايا المبرمج. يحدث ذلك قبل ظهور خصائص موت الخلايا المبرمج النووي (تركيز الكروماتين، تكسر الحمض النووي). بمجرد انهيار الجهد الغشائي للميتوكوندريا، يصبح موت الخلايا المبرمج غير قابل للعكس. يتيح وجود الجهد الغشائي للميتوكوندريا لبعض الأصباغ الفلورية الكاتيونية المحبة للدهون مثل رودامين 123، JC-1، JC-10 الارتباط بمصفوفة الميتوكوندريا. يشير زيادة أو نقصان فلورسنتها إلى زيادة أو نقصان السالبية الكهربية للغشاء الداخلي للميتوكوندريا.

يستخدم JC-1 على نطاق واسع للكشف عن إمكانات غشاء الميتوكوندريا △ΨM، مما يدل على تراكم يعتمد على الإمكانات في الميتوكوندريا. في الميتوكوندريا الطبيعية، تتجمع JC-1 في مصفوفة الميتوكوندريا لتكوين بوليمر، والذي يصدر فلورسنت أحمر قوي (ex=585 نانومتر، em=590 نانومتر)؛ في الخلايا الميتة، يتم استقطاب الجهد عبر الغشاء الميتوكوندريا، ويتم إطلاق JC-1 من الميتوكوندريا، وينخفض ​​التركيز، وينعكس إلى شكل المونومر الذي ينبعث منه الفلورسنت الأخضر. لذلك فإن تغير اللون يعكس بشكل مباشر التغير في جهد غشاء الميتوكوندريا. يمكن أيضًا قياس درجة استقطاب الميتوكوندريا من خلال نسبة شدة الفلورسنت الأحمر/الأخضر. يعد الكشف عن JC-1 طريقة شائعة.

3. موت الخلايا المبرمج المتأخر: طريقة TUNEL (طريقة وسم شظايا الحمض النووي في الموقع)

في المرحلة المتأخرة من موت الخلايا المبرمج، يتم إنتاج عدد كبير من نهايات 3-OH اللزجة بسبب كسر السلسلة المزدوجة أو كسر السلسلة المفردة من الحمض النووي الكروموسومي. تحت تأثير ناقلة الطرفية من ديوكسي ريبونوكليوتيد (TdT)، يمكن ربط dUTP المسمى باللوسيفيراز بالطرف الثالث من الحمض النووي، بحيث يمكن اكتشاف الخلايا الميتة، وتسمى هذه الطرق بعلامة نهاية dUTP بوساطة ديوكسي نيوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفية (TUNEL). نظرًا لأن الخلايا الطبيعية أو المتكاثرة لا تحتوي تقريبًا على أي كسر في الحمض النووي، فلا يوجد تكوين 3-OH ويمكن صبغ القليل منها. TUNEL هو في الواقع طريقة بحث تجمع بين علم الأحياء الجزيئي والشكل. يمكن أن يعكس التلوين الموضعي لنواة موت الخلايا المبرمج الكاملة أو الجسم الميت بدقة الخصائص البيوكيميائية والشكلية النموذجية لموت الخلايا المبرمج. يمكن استخدامه لتحديد مورفولوجيا الخلايا في أقسام الأنسجة المضمنة بالبارافين، وأقسام الأنسجة المجمدة، والخلايا المزروعة والخلايا المعزولة من الأنسجة، ويمكنه اكتشاف عدد صغير جدًا من الخلايا الميتة، لذلك، يتم استخدامه على نطاق واسع في دراسة موت الخلايا المبرمج.

المنتجات ذات الصلة: