DNase I وتطبيقاته في الطب الحيوي
إن ديوكسي ريبونوكلياز I (DNase I) عبارة عن إنزيم نوكلياز داخلي، ولا يقتصر استخدامه على الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي فحسب، بل إنه يُستخدم أيضًا في تحليل بصمة الحمض النووي، وإنشاء مكتبات عشوائية للحمض النووي، وتقليل اللزوجة في محاليل الخلايا أو المستخلصات البروتينية، إلخ. وباختصار، يمكن استخدام DNase I في أي تطبيق تقريبًا يتطلب انقسام الحمض النووي بواسطة إنزيم. وفيما يلي مقدمة تفصيلية عن DNase I وتطبيقاته المحددة.
1. ما هو DNase I؟
2. DNase I لتحضير استخلاص الحمض النووي الريبي الخالي من الحمض النووي
3. DNase I للنسخ في المختبر لإزالة قالب DNA
4. DNase I لإزالة rRNA
5. DNase I لوسم الحمض النووي
6. تطبيقات أخرى
7. دليل اختيار منتج DNase I
1. ما هو DNase I؟
ديوكسي ريبونوكلياز 1 (DNase I) إن إنزيم DNase I هو إنزيم نوكلياز غير محدد يمكنه هضم الحمض النووي أحادي السلسلة أو مزدوج السلسلة، والذي يوجد في أنسجة وسوائل الجسم المختلفة. يمكنه تحليل الروابط الفوسفوديسترية لإنتاج نيوكليوتيدات أحادية وأوليجوديوكسي تحتوي على مجموعة فوسفات 5' ومجموعة هيدروكسيد 3'. يتراوح نطاق الرقم الهيدروجيني الأمثل لإنزيم DNase I بين 7 و8، ويعتمد نشاطه على Ca2+، ويمكن تنشيطه بواسطة أيونات معدنية ثنائية التكافؤ مثل Mn2+ وMg2+ وZn2+، إلخ. في وجود Mg2+، يقوم إنزيم DNase I بقص أي موقع من الحمض النووي مزدوج السلسلة بشكل عشوائي؛ وفي وجود Mn2+، يمكن أن يقوم إنزيم DNase I بقص الحمض النووي مزدوج السلسلة في نفس الموقع لتشكيل نهاية غير حادة أو نتوءات لزجة مكونة من 1-2 نيوكليوتيد.
الشكل 1. مخطط تخطيطي لتقسيم dsDNA بواسطة DNase I في وجود Mg2+ و Mn2+.
على الرغم من أن انقسامات DNase I تعتبر عمومًا انقسامات غير محددة، إلا أن DNase I أكثر عرضة للتأثير على أجزاء معينة من التسلسل، مثل منطقة الأخدود الصغير، وأكثر عرضة لانقسامات تسلسلات البيورين-البيريميدين. ومع ذلك، عندما يعمل DNase I على dsDNA غير المتجانس، سيتم انقسام جميع القواعد الأربع، ولن يكون التأثير على قاعدة معينة أكبر من تأثير القواعد الأخرى بأكثر من 3 مرات.
2. DNase I لتحضير استخلاص الحمض النووي الريبي الخالي من الحمض النووي
في التجارب البيولوجية، تتمثل الخطوة الأولى في تحضير الحمض النووي لدراسة الوظائف المختلفة للحمض النووي الريبي. ومع ذلك، نظرًا لأن الحمض النووي والحمض النووي الريبي غالبًا ما يتم إطلاقهما معًا أثناء عملية تحلل الخلايا، فلا يمكن تجنب التداخل بينهما بغض النظر عن محلول الاستخلاص المستخدم، لذلك يلزم استخدام إنزيمات محددة لإزالة التداخل. لاستخراج الحمض النووي الريبي عالي الجودة، يتم استخدام DNase I لإزالة الحمض النووي المتبقي من العينة.
يمكن لـ DNase I تحلل الحمض النووي ثنائي السلسلة والحمض النووي أحادي السلسلة إلى أوليغونوكليوتيدات ونوكليوتيدات مفردة، ويمكن تحلل الحمض النووي في منتج تحضير الحمض النووي الريبي بشكل فعال. ثم يتم تعطيل DNase I عن طريق التسخين باستخدام عازل توقف. أثناء عملية التسخين، يمكن فتح البنية الشائكة لجزيء الحمض النووي الريبي، مما يسهل دخول الحمض النووي الريبي مباشرة إلى عملية النسخ العكسي.
ستؤثر جودة الحمض النووي الريبي بشكل مباشر على البيانات التجريبية إلى حد كبير. بشكل عام، لا يمكن تجنب بقايا الحمض النووي الريبي تمامًا أثناء استخلاص الحمض النووي الريبي، لذلك يوصى عمومًا بمعالجة عينات الحمض النووي الريبي باستخدام DNase I لهضم بقايا الحمض النووي الريبي قبل التطبيقات اللاحقة الصعبة (مثل تحليل تعبير mRNA، وتحليل النسخ، وما إلى ذلك). يمكن تنفيذ خطوة هضم الحمض النووي الريبي أثناء استخلاص الحمض النووي الريبي، أو بعد استخلاص الحمض النووي الريبي، أو قبل النسخ العكسي للحمض النووي الريبي.وفقًا لوضع المنتج، فإن المنتجات التي تقدمها Yeasen هي كما يلي:
الجدول 1: قائمة المنتجات المتعلقة بإزالة الحمض النووي أو استخلاص الحمض النووي الريبي قبل النسخ العكسي
| تحديد موقع المنتج | اسم المنتج | قطة # |
| استخراج الحمض النووي الريبوزي | كاشف استخلاص الحمض النووي الريبي الكلي TRIeasy™ [الاستفسار] | 10606ES |
| 19221ES | ||
| مجموعة MolPure™ Plant Plus RNA [الاستفسار] | 19292ES | |
| مجموعة MolPure™ للحمض النووي/الحمض النووي الريبوزي الفيروسي [الاستفسار] | 19321ES | |
| إزالة الحمض النووي الجيني | 10325ES | |
| النسخ العكسي | Hifair™ 31st Strand cDNA Synthesis SuperMix لـ qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES |
| تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي | 11184ES |
3. DNase I للنسخ في المختبر لإزالة قالب DNA
تستخدم عملية النسخ في المختبر (IVT) بشكل أساسي الحمض النووي كقالب، بالإضافة إلى الركائز والمخازن المقابلة للحصول على الحمض النووي الريبي من خلال النسخ في المختبر. في تجارب النسخ في المختبر، تُستخدم بوليميرات الحمض النووي الريبي مثل T7 وT3 وSP6 بشكل شائع لتخليق الحمض النووي الريبي. قد يحتوي الحمض النووي الريبي المُصنَّع على بقايا الحمض النووي. إن إزالة بقايا الحمض النووي مفيد لتطوير التجارب اللاحقة. على سبيل المثال، في مرحلة تطوير لقاح mRNA، تعد إزالة البقايا خطوة حاسمة، والتي يمكن أن تقلل من صعوبة التنقية اللاحقة وتزيد من نقاء المنتج. تتم إزالة قالب الحمض النووي عادةً باستخدام DNase I المُعاد تركيبه (خالي من RNase).وفقًا لعملية تركيب mRNA، فإن المنتجات التي توفرها Yeasen هي كما يلي:
| عملية تركيب mRNA | اسم المنتج | قطة# |
| إعداد القالب | بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Hieff Canace™ Plus [الاستفسار] | 10148ES |
| 10922ES | ||
| 10125ES | ||
| فنكت™بي اس ايه اي [الاستفسار] | 15005ES | |
| فانيكت™ اكس بي اي [الاستفسار] | 15033ES | |
| BspQI[استفسار] [الاستفسار] | 16215ES | |
| النسخ في المختبر | 10623ES | |
| بوليميراز الحمض النووي الريبوزي UCF.ME™T7 من الدرجة GMP (50 وحدة/ميكرولتر) | 10624ES | |
| بوليميراز الحمض النووي الريبوزي T7 (50 وحدة/ميكرولتر)[الاستفسار] | 10618ES | |
| 10133ES | ||
| 10620ES | ||
| 10621ES | ||
| إزالة قالب الحمض النووي | 10611ES | |
| تعديل mRNA | 10614ES | |
| 10612ES | ||
| 10132ES | ||
| 10619ES | ||
| تنقية mRNA | 12602ES |
4. DNase I لإزالة rRNA
في الجسم الحي، يكون rRNA وفيرًا للغاية ومحافظًا للغاية، وهو أمر ذو أهمية قليلة في الحصول على المعلومات البيولوجية، لذلك غالبًا ما يتم إزالة rRNA أولاً في بناء مكتبة RNA وتسلسلها.في الوقت الحاضر، تتمثل طريقة إزالة rRNA بشكل أساسي في هضم RNase H. تظهر الخطوات الرئيسية لاستنزاف rRNA القائم على الأنزيم في الشكل 2:
الشكل 2: مخطط تخطيطي لمبدأ استنزاف الرنا الريبوسومي القائم على الأنزيم (Baldwin, A. et al. 2021, Current Protocols)
أولاً، يتم استخراج الحمض النووي الريبي الكامل، ثم يتم تهجين مسبار الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة مع الحمض النووي الريبي الريبوسومي، ثم يتم تصميم وتصنيع مسبار الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة الخاص بالحمض النووي الريبي الريبوسومي، ثم يتم استخدام RNase H لتحليل الحمض النووي الريبي الريبوسومي الهجين، ثم يتم استخدام DNase I لتحليل مسبار الحمض النووي الريبوزي. وأخيراً، يتم ترك قالب الحمض النووي الريبوزي غير الريبوسومي. المنتجات المتعلقة بإزالة الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي التي توفرها شركة Yeasen هي كما يلي:
| عملية تركيب mRNA | اسم المنتج | قطة# |
| الإنسان/الفأر/الجرذ استنزاف الرنا الريبوسومي | هييف NGS™ مجموعة MaxUp لاستنزاف rRNA (الإنسان/الفأر/الجرذ) MaxUp [الاستفسار] | 12253ES |
| استنزاف الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي للنبات | 12254ES | |
| إزالة الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي ومناطق 45S ITS/ETS من الحمض النووي الريبوزي الكلي البشري | هييف NGS™ مجموعة MaxUp Human rRNA Depletion Kit (rRNA & ITS/ETS) | 12257ES |
| تحلل الرنا الريبوسومي | 12906ES | |
| تحلل مسبار الحمض النووي | 10325ES |
5.DNase I لوسم الحمض النووي
تعد عملية ترجمة النك واحدة من أكثر طرق وسم مسبار الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين شيوعًا في المختبرات. تستخدم هذه الطريقة أنشطة إنزيمية مختلفة لبوليميراز الحمض النووي من النوع الأول لدمج ثلاثي فوسفات الديوكسي ريبونوكليوزيد المسمى في سلاسل الحمض النووي التي تم تصنيعها حديثًا. وبالتالي، يتم تصنيع مسبارات الحمض النووي المسمى بشكل موحد للنشاط النوعي العالي. تتميز عملية ترجمة النك بأنها سريعة وبسيطة ومتعمدة وذات خصوصية عالية ومسبارات مسمى بشكل موحد، وهي مناسبة للحمض النووي ثنائي السلسلة الأطول.يتم تنفيذ هذه الطريقة من خلال العمل المشترك لـ DNase I و E. coli DNA Polymerase I. وتوضح الشكل 3 الخطوات الرئيسية لتمييز الحمض النووي عن طريق الترجمة الشفوية:
الشكل 3: مخطط تخطيطي لتمييز الحمض النووي عن طريق ترجمة النك
يتم استخدام تركيز مناسب من DNase I لإنشاء عدة فجوات أحادية السلسلة على كل خيط من DNA مزدوج السلسلة المراد وسمه، ويتم تشكيل الطرف الهيدروكسيلي 3' عند الفجوة. استخدم نشاط إكسونوكلياز 5'→3' لبوليميراز DNA I الخاص بـ E. coli لقطع نوكليوتيد من الطرف 5' للشق، وفي نفس الوقت يقوم نشاط بوليميراز 5'→3' لبوليميراز DNA I الخاص بـ E. coli بإدخال نوكليوتيد مُوسم بالطرف 3' للفجوة لإصلاح الفجوة. مع تحرك الفجوة على طول خيط DNA، يتم دمج النيوكليوتيدات المُوسمة في الخيط المُصنَّع حديثًا.المنتجات المتعلقة بوضع العلامات على الحمض النووي التي تقدمها شركة Yeasen هي كما يلي:
| تحديد موقع المنتج | اسم المنتج | قطة# |
| عادي | ديوكسي ريبونوكلياز 1 (DNase I) من بنكرياس البقر [الاستفسار] | 10607ES/10608ES |
| خالي من RNase | 10325ES | |
| الإشريكية القولونية مصدر | 12903ES |
6. تطبيقات أخرى
ما سبق هو العديد من التطبيقات الشائعة الاستخدام. تتضمن التطبيقات الأخرى لـ DNase I ما يلي، مثل اختبار بصمة DNase I والمواقع شديدة الحساسية لـ DNase I. اختبار بصمة DNase I هو طريقة كشف يمكنها تحديد مواقع ارتباط البروتينات المرتبطة بالحمض النووي على الحمض النووي بدقة. عندما يرتبط البروتين بقطعة من الحمض النووي، يمكنه حماية موقع الارتباط من التلف بواسطة DNase I وستبقى قطع الحمض النووي بعد هضم الإنزيم ("البصمة")، ويمكن تحديد تسلسلها. في صورة الهلام، لا توجد أشرطة حيث يرتبط الحمض النووي بالبروتين. لقراءة المزيد اضغط على الرابطتشير المواقع شديدة الحساسية لـ DNase I إلى انقسامات في عدد صغير من المواقع المحددة عندما يتم معالجة الكروماتين بكمية منخفضة من DNase I وتسمى هذه المواقع المحددة بالمواقع شديدة الحساسية لـ DNase I. والمبدأ هو أنه عندما يكون الجين في حالة نشطة نسخيًا، يكون الكروماتين الذي يحتوي على الجين أكثر حساسية بشكل ملحوظ لتحلل DNase من المنطقة غير النشطة. لقراءة المزيد انقر على الرابط.
7. دليل اختيار منتج DNase I
تأسست شركة Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. في عام 2014، وهي شركة ذات تكنولوجيا عالية تعمل في مجال البحث والتطوير وإنتاج المواد الخام للإنزيمات والأجسام المضادة للمستضدات. تشمل منتجاتها الإنزيمات التشخيصية الجزيئية والبروتينات والأجسام المضادة المستخدمة في الصناعات الدوائية واختبار سلامة الأغذية والتربية والعدالة وغيرها من الصناعات. نحن ملتزمون بتزويد العملاء في مجال العلوم الحيوية بمنتجات وخدمات عالية الجودة. إرشادات شراء المنتج لـ DNase I هي كما يلي:| اسم المنتج (رقم القطة) | تحديد موقع المنتج | التطبيقات الموصى بها |
| DNase I من بنكرياس البقر (CAT#10607،10608)[الاستفسار] | تم إزالة RNase، ولم يتم الكشف عنه | يستخدم بشكل رئيسي في أبحاث البروتين: إزالة الحمض النووي من مستحضرات البروتين. |
| DNase I المعاد تركيبه (خالي من RNase)(القط رقم 10325) | خالي من RNase، للأبحاث | مثالي لمجموعة متنوعة من التطبيقات: إزالة الحمض النووي من مستحضرات الحمض النووي الريبي والبروتين مثل مكتبات الحمض النووي الريبي التكميلي الحساسة لـ RNase أو تحضير العينة لتجارب RT-PCR. |
| UCF.ME™Deoxyribonuclease I (DNase I) بدرجة GMP(القط رقم 10611) | خالي من RNase، درجة صيدلانية GMP. | مثالي لمجموعة متنوعة من التطبيقات: إزالة الحمض النووي من مستحضرات الحمض النووي الريبي والبروتين مثل مكتبات الحمض النووي الريبي التكميلي الحساسة لـ RNase أو تحضير العينة لتجارب RT-PCR. |
فيما يتعلق بالقراءة:
كواشف من الدرجة GMP لتخليق mRNA في المختبر
مبادئ بصمة DNase I وتطبيقاتها الطبية الحيوية
مراجع
1. بالدوين أ، موريس أ، موخيرجي ن. طريقة سهلة وفعّالة من حيث التكلفة وقابلة للتطوير لاستنزاف الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي البشري لـ RNA-seq[J]. البروتوكولات الحالية، 2021.
2. سونغ سي، تشانغ إس، هوانغ إتش. اختيار طريقة مناسبة لتحديد أصول التضاعف في الجينومات الميكروبية[J]. Frontiers in Microbiology، 2015، 6:1049.