ما هي الإنزيمات التي يستخدمها العلماء لربط جين جديد؟ وغني عن القول أن رباط الحمض النووي من ضمنها. فلماذا إذن يعتبر رباط الحمض النووي مهمًا جدًا في الحمض النووي المؤتلف؟ لأن رباط الحمض النووي مسؤول عن ربط القطعة المستهدفة بالناقل، وهو أحد العناصر الرئيسية التي تحدد نجاح التجربة. كنوع من رباط الحمض النووي، ما الدور الذي يلعبه رباط الحمض النووي T4 في تجارب الاستنساخ الجزيئي؟ كيف يعمل؟ سيتم تقديم رباط الحمض النووي T4 بالتفصيل لاحقًا.

1. ما هو T4 DNA Ligase؟
2. ما هي وظيفة رباط الحمض النووي T4؟
3. يمكن استخدام رباط الحمض النووي T4 من شركة Yeasen Biotech لربط محول NGS
4. دليل اختيار لـ Yeasen Biotech T4 DNA ligase

1. ما هو T4 DNA Ligase؟

إن رباط الحمض النووي T4 هو رباط يعتمد على ATP يحفز تفاعل الربط بين جزيئات الحمض النووي. وهو يشكل بشكل أساسي ثنائي الإستر الفوسفوري عن طريق ربط طرفي 3'-هيدروكسيل و5'-فوسفات. وتشارك رباطات الحمض النووي في عمليات تكرار الحمض النووي وإصلاحه في جميع الكائنات الحية. يتم إنتاج رباط الحمض النووي T4 المشفر بواسطة البكتيريا العصوية أثناء إصابة البكتيريا القولونية بالبكتيريا العصوية T4.
إن الليجازات المستخدمة في الهندسة الوراثية هي بشكل أساسي ليجاز DNA الخاص ببكتيريا E. coli وليجاز DNA T4، حيث يتم استخدام الأخير على نطاق واسع في الوقت الحاضر. يمكن أن يقوم ليجاز DNA T4 بإصلاح الشقوق أحادية السلسلة في DNA مزدوج السلسلة، أو RNA مزدوج السلسلة، أو خيوط DNA/RNA الهجينة لربط نوكليوتيدتين متجاورتين، ويلعب دورًا مهمًا في إصلاح DNA وإعادة تركيبه.
في عملية بناء البلازميد المؤتلف، يمكن استخدام رباط الحمض النووي T4 مع إنزيمات القيد لإكمال تجربة بناء البلازميد المؤتلف. يمكنه تحفيز تكوين رابطة فوسفوديستر بين الطرف 5'-P والطرف 3'-OH للحمض النووي ثنائي السلسلة ولديه كفاءة اتصال جيدة للاتصال الطرفي اللزج والاتصال الطرفي غير الحاد.

الشكل 1. آلية ربط الحمض النووي T4

2. ما هي وظيفة رباط الحمض النووي T4؟

2.1 بناء المتجهات

في تجارب بناء المتجهات، يمكن لإنزيمات القيد المختلفة إنتاج أنواع مختلفة من النهايات. وبالنسبة للنهايات المختلفة، سيكون لدى رباط الحمض النووي T4 استراتيجيات ربط مختلفة.

2.1.1 الاستنساخ باستخدام إنزيمات القيد، النهايات اللزجة التي تنتجها عملية الهضم الفردية

أثناء بناء المتجه، إذا تم استخدام نفس نوكلياز القيد لقطع جزء DNA من الجين المستهدف وكان جزيء المتجه قادرًا على إنتاج نفس النهاية اللاصقة، فيمكن لربط DNA T4 أن يقوم مباشرة بعملية إعادة التركيب. ومع ذلك، نظرًا لأن النهايات اللاصقة هي نفسها، يمكن إدخال الجين المستهدف في المتجه في الاتجاه الأمامي أو العكسي، مما سيزيد بسهولة من عبء عمل الفحص بحثًا عن استنساخات معاد التركيب الصحيحة. ضع في اعتبارك استخدام طريقة الهضم المزدوج للإنزيم لبناء المتجه.
بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضًا إقران الأطراف المتماسكة للناقل المحضر عن طريق الهضم الإنزيمي الفردي، ثم تتشكل روابط فوسفوديستر بين النوكليوتيدات تحت تأثير رباط الحمض النووي T4، مما يؤدي إلى ربط الناقل ذاتيًا. يمكن استخدام الفوسفاتاز القلوي لعلاج الناقل المهضوم لإزالة مجموعة الفوسفات في الطرف 5' من الناقل بحيث لا يتمكن الناقل من إكمال الربط الذاتي. وبالتالي، تحت تأثير رباط الحمض النووي T4، يتم ربط الناقل والجزء المستهدف لإكمال بناء الناقل المؤتلف.

2.1.2- الاستنساخ باستخدام إنزيمات القيد، والنهايات اللزجة الناتجة عن الهضم المزدوج

في عملية بناء المتجه، إذا تم استخدام إنزيمين تقييديين بنهايات لاصقة مختلفة لهضم القطعة المستهدفة والناقل على التوالي، يمكن إنشاء نهايتين لاصقتين مختلفتين. في هذه المرحلة، يمكن لربط الحمض النووي T4 ربط نفس النهايات اللاصقة بشكل انتقائي لضمان إدخال القطعة المستهدفة في الناقل في الاتجاه الصحيح. عندما يتم هضم القطعة المستهدفة والناقل في الشكل 2 باستخدام EcoR I وBamH I في نفس الوقت، يمكن ربط نفس النهايات اللاصقة. يوجد اتجاه ربط واحد فقط بين القطعة المستهدفة والناقل.

الشكل 2. ربط النهاية اللزجة الناتج عن الهضم المزدوج للإنزيم^[1]

2.1.3 استنساخ شظايا التقييد، النهاية الحادة

يمكن لبعض نوكليازات القيد أيضًا توليد نهايات غير حادة أثناء الانقسامات الأنزيمية، مثل Sma I وغيرها. يمكن أن يشكل رباط DNA T4 مباشرةً رابطة فوسفوديستر بين الناقل والإدراج، ولا توجد حاجة للاقتران بين القواعد. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة لها كفاءة ربط منخفضة وهي عرضة لربط الناقل ذاتيًا. بشكل عام، يمكن تحويل النهايات غير الحادة إلى نهايات لزجة ثم ربطها. على سبيل المثال، يؤدي إضافة قواعد بولي أ وبولي تي التكميلية إلى نهايات القطعة المستهدفة والناقل والنهايات التكميلية اللزجة بشكل مصطنع على التوالي إلى تحسين كفاءة الاتصال بواسطة ديوكسينوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفي.

2.1.4 استنساخ TA

إن ناقل T المستخدم في استنساخ TA له نتوء T عند الطرف 3'. وعندما يكون تسلسل DNA للجزء المستهدف غير واضح، يمكن توصيل جزء الجين المستهدف بناقل T عن طريق استنساخ TA، ويمكن تحديد الجين المستهدف عن طريق التسلسل. إن بوليميراز DNA Taq المستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل له نشاط ترانسفيراز طرفي ويمكنه إضافة نوكليوتيد "A" إلى الطرف 3' من جزء DNA. يمكن لربط DNA T4 أن يربط مباشرة المنتج المضخم بواسطة بوليميراز DNA Taq بناقل T، ويمكن للمنتج المضخم عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل أن يحقق غرض الاستنساخ الفعال دون إضافة محولات اصطناعية.

الشكل 3. سير عمل استنساخ TA^[2]

2.2 ربط محول NGS

أثناء إنشاء مكتبة التسلسل من الجيل التالي، من الضروري توصيل المحول الاصطناعي بمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل قبل تثبيته على خلية التدفق في شريحة التسلسل لإكمال التسلسل. يعد بناء مكتبة رابط استنساخ TA وسيلة تقنية شائعة جدًا، ومبدأها مشابه لاستنساخ TA المذكور أعلاه. بعد فسفرة جزء الحمض النووي المراد تسلسله عند الطرف 5' وإضافة "A" عند الطرف 3'، يتم تكميله وإقرانه بالمحول بالطرف اللاصق "T". ثم يتم تشكيل الشريط المزدوج الكامل وتسلسله بواسطة الآلة.
أثناء ربط TA، فإن أنواع العينات المختلفة أو تعقيد بنية شظية الحمض النووي سوف تؤثر على كفاءة الربط، وبالتالي فإن محولات المنصات المختلفة سوف يكون لها أيضًا تأثير على النتيجة النهائية للمكتبة.
على سبيل المثال، يحتوي محول Bubble الخاص بمنصة MGI على بنية ثانوية خاصة ويتطلب كفاءة ربط عالية جدًا لربط الحمض النووي T4، ويؤثر انخفاض كفاءة الربط بشكل مباشر على ناتج المكتبة.

الشكل 4. عملية ربط المحول العامة

3.يمكن استخدام رباط الحمض النووي T4 من شركة Yeasen Biotech لربط محول NGS

تم تطوير Yeasen Biotech خصيصًا رباط الحمض النووي السريع T4 لربط شظايا الحمض النووي والمحولات في عملية بناء مكتبة NGS. يتمتع الإنزيم بقدرة ربط فعالة، ليس فقط سرعة اتصال سريعة ولكن أيضًا متوافق مع أنواع مختلفة من العينات، وهو أكثر فائدة لربط شظايا الحمض النووي بالهياكل المعقدة. في الوقت الحاضر، تم التحقق من ذلك من خلال تسلسل عالي الإنتاجية لعدد كبير من العملاء. لتوصيل محولات Bubble على منصة MGI، يمكن أيضًا الحصول على جودة تسلسل ممتازة.

3.1 إنزيم ربط الحمض النووي Fast T4 من شركة Yeasen Biotech يتميز بكفاءة ربط عالية للغاية

استخدم Yeasen Biotech Fast T4 DNA ligase لإنشاء مكتبات بأنواع مختلفة من المحولات. العينة عبارة عن محاكي cfDNA بطول 170 زوجًا قاعديًا، ويتم استخدام مكتبة Agilent 2100 للكشف عن النتائج. ① منتج محول غير متصل؛ ② منتج محول أحادي الطرف؛ ③ منتج محول ثنائي الطرف؛ ④ محول متبقي. من النتائج، يمكن ملاحظة أن كفاءة ربط المحولات أحادية الطرف ومزدوجة الطرف عالية جدًا.

الشكل 5. أنواع مختلفة من منتجات الربط التي تم اكتشافها بواسطة جهاز Agilent 2100

3.2 إنزيم ربط الحمض النووي Fast T4 من شركة Yeasen Biotech مع إنتاج مكتبة ممتاز

باستخدام رباط الحمض النووي السريع T4 لأنواع مختلفة من بناء المكتبة، وبالمقارنة برباط الحمض النووي T4 الآخر، فإن إنتاجية المكتبة تكون أفضل.

الجدول 1. إنتاج المكتبات من أنواع مختلفة من العينات

4. دليل اختيار لـ Yeasen Biotech T4 DNA ligase

Yeasen هي شركة تكنولوجيا حيوية تعمل في مجال البحث والتطوير والإنتاج وبيع ثلاثة كواشف بيولوجية رئيسية: الجزيئات والبروتينات والخلايا. بالإضافة إلى Fast T4 DNA ligase، تمتلك Yeasen Biotech أيضًا رباط الحمض النووي الجديد T4 و رباط الحمض النووي السريع T4 للاختيار من بينها. يمكنك اختيارها بناءً على التطبيقات المعروضة في الجدول التالي:

الجدول 2: المنتجات ذات الصلة

مراجع

[1] W. Yuan. Gene Engineering[M]. Chemical Industry Press، 2019.
[2] Clark DP، Pazdernik NJ، Mcgehee M R. استنساخ الجينات لعلم الأحياء الاصطناعي - ScienceDirect[J]. علم الأحياء الجزيئي (الطبعة الثالثة)، 2019: 199-239.
[3] Tomkinson AE, Vijayakumar S, Pascal JM, et al. DNA Ligases: Structure, Reaction Mechanism, and Function[J]. Chemical Reviews, 2006, 106(2):687-699.
[4] شومان س. رباطات الحمض النووي: التقدم والآفاق[م]. مجلة الكيمياء الحيوية، 2009، 284(26):17365-17369.