الشكل 1. مخطط تخطيطي لإنزيم DNase I وهو يقطع الحمض النووي ثنائي السلسلة في وجود المغنيسيوم²⁺ و من²⁺

يتم تنقية DNase I الشائع في المقام الأول من بنكرياس الأبقار أو أنه إنزيم معاد التركيب. وبالمقارنة مع DNase I المنقى من بنكرياس الأبقار، فإن DNase I المعاد تركيبه يحتوي على مستويات RNase داخلية أقل نسبيًا أو يمكن صياغته كمنتجات خالية من RNase، مما يجعله أكثر ملاءمة للتطبيقات الحساسة لـ RNase، مثل إزالة الحمض النووي من عينات الحمض النووي الريبي.

التطبيقات

فيما يتعلق بالتطبيقات، يُعرف DNase I جيدًا باستخدامه في التجارب المتعلقة بالحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي، مثل استخراج الحمض النووي الريبي خاليًا من الحمض النووي، وإعداد قوالب الحمض النووي الريبي بدون gDNA قبل النسخ العكسي، وتحلل قوالب الحمض النووي بعد النسخ في المختبر. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدامه لهضم مجسات الحمض النووي في إزالة الحمض النووي الريبي الريبوزي منقوص الأكسجين، لوضع علامات على الحمض النووي من خلال ترجمة الشق، وتحليل تفاعلات الحمض النووي والبروتين باستخدام طريقة البصمة، وإنشاء مكتبات عشوائية للحمض النووي، وتقليل لزوجة محاليل الخلايا أو مستخلصات البروتين، وهضم التصاقات الخلايا كمادة مضافة في زراعة الخلايا، وشق الحمض النووي الجينومي جزئيًا كعنصر تحكم إيجابي في اختبارات TUNEL للكشف عن موت الخلايا المبرمج. باختصار، يمكن استخدام DNase I في أي تطبيق تقريبًا يتطلب الهضم الأنزيمي للحمض النووي. فيما يلي، سيتم تقديم مقدمة موجزة للعديد من التطبيقات الشائعة.

• إزالة gDNA قبل استخراج الحمض النووي الريبي أو النسخ العكسي

يؤثر الحمض النووي الريبي، باعتباره عينة مدروسة بشكل شائع في المختبرات، بشكل كبير على جودة البيانات التجريبية بسبب جودته الخاصة. من المستحيل عمومًا تجنب بقايا الحمض النووي الريبي تمامًا أثناء عملية استخراج الحمض النووي الريبي. لذلك، قبل إجراء تطبيقات لاحقة صعبة (مثل تحليل تعبير mRNA، وتحليل النسخ، وما إلى ذلك)، يوصى عادةً بمعالجة عينات الحمض النووي الريبي باستخدام DNase I لهضم بقايا الحمض النووي الريبي. يمكن إجراء هضم الحمض النووي الريبي أثناء استخراج الحمض النووي الريبي، أو بعد استخراج الحمض النووي الريبي، أو قبل النسخ العكسي للحمض النووي الريبي.

الشكل 2. عملية إزالة gDNA المستندة إلى DNase I

• إزالة قالب الحمض النووي في النسخ المختبري

تستخدم عملية النسخ في المختبر (IVT) في المقام الأول الحمض النووي كقالب لإنتاج الحمض النووي الريبي تحت تأثير الركائز والمحاليل المناسبة. تشمل بوليميرات الحمض النووي الريبي المستخدمة بشكل شائع في هذه العملية T7 وT3 وSP6، وهي المسؤولة عن تحفيز تخليق الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، قد يحتوي منتج الحمض النووي الريبي المصنّع على بقايا الحمض النووي الريبي، والتخلص من هذه البقايا مفيد للتجارب اللاحقة.

وخاصة في عملية تطوير لقاحات mRNA، فإن إزالة بقايا الحمض النووي هذه هي خطوة حاسمة تؤثر بشكل مباشر على صعوبة عمليات التنقية اللاحقة ونقاء المنتج النهائي.من أجل إزالة قالب الحمض النووي بكفاءة، يتم استخدام DNase I عادةً للعلاج للتأكد من أن عينة الحمض النووي الريبي خالية من بقايا الحمض النووي، وهي خطوة تساعد على تحسين الدقة الشاملة وكفاءة التجربة.

الشكل 3: عملية النسخ في المختبر باستخدام البلازميد الخطي كقالب^[4]

• إزالة rRNA في بناء مكتبة RNA وتسلسلها

في الكائنات الحية، يكون rRNA وفيرًا للغاية ومحفوظًا للغاية، وهو أمر لا أهمية له للحصول على معلومات بيولوجية بحثية. ومع ذلك، فإن 95٪ من إجمالي rRNA المستخرج أثناء التجارب هو rRNA البشري، وقد يتداخل وجود هذه rRNAs مع اكتشاف RNAs المستهدفة. لذلك، في تحضير مكتبة RNA وتسلسلها، عادة ما يتم إزالة rRNA أولاً. حاليًا، الطريقة الرئيسية لإزالة rRNA هي هضم RNAase، ووظيفتها التشغيلية الرئيسية هي الخطوات والمبادئ هي كما يلي:

1. استخراج الحمض النووي الريبوزي الكلي؛
2. تهجين مجسات الحمض النووي أحادية السلسلة مع جزيئات الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (ملاحظة: تصميم وتوليف مجسات الحمض النووي أحادية السلسلة الخاصة بالحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين)؛
3. يقوم RNase H بتحليل rRNA الهجين؛
4. يقوم DNase I بتحليل مجسات الحمض النووي؛
5. تم إزالة rRNA بنجاح، وترك قوالب RNA غير rRNA.

الشكل 4: مخطط تخطيطي لمبدأ إزالة rRNA استنادًا إلى الطريقة الأنزيمية^[5]

• ترجمة الاسم المستعار لوسم الحمض النووي

تعد ترجمة النك الطريقة الأكثر استخدامًا في وسم مجسات حمض الديوكسي ريبونوكلييك في المختبر. يتم تحقيق هذه الطريقة من خلال العمل المشترك لـ DNase I و الإشريكية القولونية بوليميراز الحمض النووي I.

المبدأ الرئيسي هو كما يلي:

1. أولاً، استخدم تركيزًا مناسبًا من DNase I لإنشاء العديد من الشقوق أحادية السلسلة في كل خيط من الحمض النووي مزدوج السلسلة المراد وسمه، مما يشكل نهايات هيدروكسيل 3' في مواقع الشقوق.
2. ثم استخدم نشاط إكسونوكلياز 5'→3' لـ كولايبوليميراز الحمض النووي I لإزالة نوكليوتيد من الطرف 5' للشق، في حين أن نشاط بوليميراز 5'→3' لـ هـ. كولاي يقوم إنزيم بوليميراز الحمض النووي I بإدخال نوكليوتيد مُسمّى إلى الطرف 3' من الشق لإصلاحه. وبينما يتحرك الشق على طول شريط الحمض النووي، يتم دمج النيوكليوتيدات المُسمّاة في شريط الحمض النووي المُصنّع حديثًا.

الشكل 5: مخطط تخطيطي لمبدأ وسم الحمض النووي عن طريق ترجمة النك^[6]

• تجربة تحليل بصمة DNase I

اختبار بصمة DNase I هو طريقة دقيقة لتحديد مواقع ارتباط البروتينات المرتبطة بالحمض النووي بجزيئات الحمض النووي. والمبدأ هو أن البروتينات المرتبطة بقطعة من الحمض النووي تحمي المنطقة المرتبطة من التدهور بواسطة DNase I. وبعد الهضم الأنزيمي، يمكن استخدام القطعة المتبقية ("البصمة") لتحديد تسلسلها. وفي صورة الهلام، لا توجد أشرطة تتوافق مع المناطق التي يرتبط بها البروتين.

المبدأ الرئيسي هو كما يلي:

1. قم بوضع علامة على نهايات السلسلة المفردة لجزيء الحمض النووي ثنائي السلسلة الذي سيتم اختباره.
2. قم بخلط البروتين مع الحمض النووي وأضف كمية مناسبة من DNase I للهضم الأنزيمي، مما يؤدي إلى تشكيل أجزاء من الحمض النووي بأطوال مختلفة.يجب التحكم في كمية الإنزيم للتأكد من أن أجزاء الحمض النووي المتجاورة تختلف بمقدار نوكليوتيد واحد فقط، ويجب تضمين عنصر تحكم بدون إضافة بروتين بالتوازي.
3. قم بإزالة البروتين من الحمض النووي، ثم افصل الحمض النووي المشوه عن طريق التحليل الكهربائي PAGE، ثم استخدم التصوير الشعاعي لتفسير تسلسل النوكليوتيدات في منطقة البصمة من خلال المقارنة مع مجموعة التحكم.

الشكل 6: مخطط تخطيطي لمبدأ اختبار بصمة DNase I^[7]

ال DNase I دليل اختيار ييسن

لتلبية احتياجات التطبيقات المختلفة، تقدم Yeasen مُعاد التركيب DNase I في الإشريكية القولونيةويمكنه توفير DNase I من الدرجة GMP لتلبية متطلبات النسخ mRNA في المختبر والتطبيقات الأخرى.

تحديد موقع المنتج	طلب	اسم المنتج	رقم الكتالوج
خالي من RNase	إزالة الحمض النووي من مستحضرات الحمض النووي الريبي والبروتين	DNase I المعاد تركيبه (خالي من RNase)	10325ES
درجة GMP، خالي من RNase	نسخ mRNA في المختبر	UCF.ME® Deoxyribonuclease I (DNase I) بدرجة GMP	10611ES

مراجع

[1] Ndiaye C، Mena M، Alemany L، وآخرون. اكتشاف الحمض النووي لفيروس الورم الحليمي البشري، وE6/E7 mRNA، وp16INK4a في سرطانات الرأس والرقبة: مراجعة منهجية وتحليل تلوي[J]. مجلة لانسيت لعلم الأورام، 2014، 15(12): 1319-1331.

[2] Broccolo F، Fusetti L، Rosini S، وآخرون. مقارنة بين حمولة الحمض النووي الفيروسي النوعي لفيروس الورم الحليمي البشري المسبب للسرطان واكتشاف mRNA E6/E7 في عينات عنق الرحم: نتائج من دراسة متعددة المراكز[J]. مجلة علم الفيروسات الطبية، 2013، 85(3): 472-482.

[3] Huang Z، Fasco MJ، Kaminsky L S. تحسين إزالة Dnase I من الحمض النووي الملوث من الحمض النووي الريبي للاستخدام في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للحمض النووي الريبي [J]. Biotechniques، 1996، 20 (6): 1012-1020.

[4] Kang DD، Li H، Dong Y. التطورات في النسخ المختبري لـ mRNA (IVT mRNA) لتمكين الترجمة إلى العيادات [J]. Advanced Drug Delivery Reviews، 2023، 199: 114961.

[5] Wiame I، Remy S، Swennen R، وآخرون. Irreversible heat inactivation of DNase I without RNA breakdown[J]. Biotechniques، 2000، 29(2): 252-256.

[6] Adolph S, Hameister H. In situ nick translation of metaphase chromosomes with biotin-labeled d-UTP[J]. Human genetics, 1985, 69: 117-121.

[7] Song C، Zhang S، Huang H. اختيار طريقة مناسبة لتحديد أصول التضاعف في الجينومات الميكروبية. فرونت ميكروبيول، 2015، 6: 1049.