إن إنزيم RNase HII، المعروف أيضًا باسم RNase H2، هو إنزيم نوكلياز داخلي يستهدف بشكل خاص ويقطع الرابطة الفوسفوديسترية عند الطرف 5' من ريبونوكليوتيد منفرد يقع داخل حلزون DNA مزدوج السلسلة، مما ينتج عنه مجموعة فوسفات 5' ومجموعة هيدروكسيل 3' (الشكل 1). يُظهِر هذا الإنزيم نشاط انقسام ضئيل تجاه الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة وهو غير نشط ضد كل من الحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA) والحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA). إن إنزيم RNase HII نشط وظيفيًا في نطاق درجات الحرارة من 50 درجة مئوية إلى 75 درجة مئوية، ويصل إلى ذروة أدائه عند درجات حرارة تتراوح بين 70 درجة مئوية و75 درجة مئوية. بفضل قدرته الفريدة على تنفيذ انقسام مستهدف في موقع واحد في مواقع الحمض النووي حيث يتم دمج الريبونوكليوتيد، دون التأثير على الحمض النووي ثنائي أو أحادي، يعمل RNase HII كـ "محفز" دقيق لبدء التفاعل، بما في ذلك تنشيط البادئ وتمديده، لتحقيق تضخيم محدد. يلعب هذا الإنزيم دورًا محوريًا في تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل المعتمد على RNase H (rhPCR)، وتقنية التضخيم الحراري المتساوي بوساطة الحلقة (LAMP)، وتحلل مكونات الحمض النووي الريبي في شظايا أوكازاكي.
الشكل 1. مخطط تخطيطي لمبدأ تفاعل RNase HII
التطبيقات الوظيفية لـ RNase HII
1. تفاعل البوليميراز المتسلسل المعتمد على RNase H(تفاعل البوليميراز المتسلسل الريبي)
تتضمن تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الريبوسومي (rhPCR) إنزيم RNase HII وبادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل الريبوسومي (rhPCR) المغلقة القابلة للانقسام والمصممة خصيصًا في عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل. ويستفيد هذا النهج من الخاصية الفريدة لإنزيم RNase HII لتحليل الحمض النووي الريبي (RNA) بشكل انتقائي داخل الهجائن المكونة من الحمض النووي الريبي (DNA-RNA)، مع ترك الروابط الفوسفوديسترية في الحمض النووي الريبي (DNA) أحادي السلسلة أو مزدوج السلسلة وحمض الريبي النووي (RNA) سليمة. ونتيجة لذلك، لا يهضم إنزيم RNase HII إلا الهجائن المكونة من الحمض النووي الريبي (DNA-RNA) ويسمح بتمديد البادئ عندما يكون البادئ مكملًا تمامًا لتسلسل الحمض النووي المستهدف. ويعزز هذا الإجراء المستهدف دقة التفاعل بشكل كبير. إن إنزيم RNase HII هو الإنزيم الوحيد القادر على بدء الإزالة الدقيقة للريبونوكليوتيدات دون التسبب في حدوث طفرات عن طريق الانقسام عند الطرف 5' من حمض الريبونوكلييك. بفضل خصوصيتها العالية وحساسيتها وإمكانية إعادة إنتاجها، توفر تقنية rhPCR مزايا مميزة في تطبيقات مثل اكتشاف تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP)، وتصنيف الجينات، والكشف المتزامن عن أهداف متعددة، وتحليل الأحماض النووية البيئية.
الطريق الفني
1. التصميم التمهيدي
يجب أن يضمن تصميم البادئ أن تكون درجة حرارة الانصهار بعد القطع أعلى من درجة حرارة التلدين لضمان ارتباط البادئ بشكل ثابت بالقالب أثناء دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل. يتكون بادئ تفاعل البوليميراز المتسلسل الريبوزي من ثلاثة أجزاء:
1) قطعة DNA بطول 5': قابلة للمقارنة من حيث متطلبات الطول ودرجة الانصهار (Tm) مع برايمرات تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسية، ويمكنها الاقتران بشكل فعال مع DNA القالب والامتداد منه بعد قطعها بواسطة إنزيم RNase HII.
2) قاعدة RNA واحدة: توفر موقع قطع لـ RNase HII.
3) قطعة DNA 3': طول مكون من أربع أو خمس قواعد مع مانع، عادة ما يكون جزيئًا قصيرًا غير قابل للتمدد مثل البروبيلين جليكول، والذي يمنع تمدد بوليميراز DNA حتى تتم إزالة المانع.
2.القطع والتمديد
في بداية تفاعل rhPCR، يكون كل من البادئ والقالب DNA حرين. وعندما يرتبط البادئ بقالب RNA:DNA heteroduplex المحدد، يتم التعرف على جانب القاعدة 5' من RNA للبادئ المحظور وقطعه بواسطة إنزيم RNase HII، مما يترك أوليجونوكليوتيد DNA مع مجموعة هيدروكسيل 3'، مما يوفر نقطة بداية لبوليميراز DNA للتمدد. يتبع ذلك عملية تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية.
الشكل 2. مخطط لمبدأ rhPCR [1]
2.التضخيم الحراري بوساطة الحلقة (LAMP)
التضخيم الحراري المتساوي الوسيط الحلقي (LAMP) هو طريقة بسيطة وسريعة لتضخيم الجينات يمكنها تضخيم الأحماض النووية في ظل ظروف حرارية متساوية في فترة زمنية قصيرة. ومع ذلك، بسبب بدء نشاط بوليميراز الحمض النووي أثناء التحضير في درجة حرارة الغرفة، تتشكل عدم تطابقات غير محددة، مما قد يؤدي إلى كمية صغيرة من الاقتران الخاطئ وثنائيات البادئ، مما يتسبب في تلوثات طفيفة قد تؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة.
إن تطبيق RNase HII على نظام تضخيم LAMP يمكن أن يعالج بفعالية مشكلة النتائج الإيجابية الكاذبة في تقنية LAMP، مما يوسع نطاق تطبيقها في التشخيصات السريرية. وكما هو موضح في الشكل 3، فإن طريقة LAMP المنشَّطة بالبرايمر (PA-LAMP) باستخدام RNase HII، عندما يقترن البرايمر بـ ssDNA المستهدف، يقوم إنزيم RNase HII بشق الحمض النووي الريبي على البرايمر على وجه التحديد، مما يؤدي إلى تنشيطه والسماح بتمديد البرايمر، وتحقيق تضخيم محدد وتقليل النتائج الإيجابية الكاذبة في النظام بشكل فعال.
الشكل 3. مخطط تخطيطي لمبدأ PA-LAMP [2]
YEASEN RNase HII
RNase HII من YEASEN (القط رقم 14539) مشتق من بيروكوكس أبيسي، بنسلفانياكما أنها خالية من النوكليازات الملوثة، والإنزيمات الكاشطة، وبقايا RNase، مع تلوث منخفض لحمض نووي المضيف، مما يقلل بشكل فعال من الإيجابيات الكاذبة في النظام. إن RNase HII من YEASEN مقاوم للحرارة للغاية، ويحافظ على نشاطه حتى بعد 30 دقيقة عند 95 درجة مئوية، مما يجعله متوافقًا مع أنظمة تفاعل rhPCR المختلفة ومناسبًا أيضًا لـ LAMP والتطبيقات الأخرى.
1. الإشريكية القولونية بقايا الحمض النووي الجينومي < 0.5 نسخة / 100 وحدة
الكشف عن الإشريكية القولونية أظهرت بقايا الحمض النووي الجينومي في دفعات مختلفة من RNase HII أن بقايا الحمض النووي الجينومي المضيف لـ RNase HII من YEASEN أقل بكثير من 0.5 نسخة / 100 وحدة.
الشكل 4. الكشف عن الإشريكية القولونية بقايا الحمض النووي الجينومي
2. اختبار مقاومة الحرارة 95 درجة مئوية
بعد تسخين RNase HII عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة تتراوح من 0 إلى 45 دقيقة، تم اختبار نشاط إنزيم RNase HII. أشارت النتائج إلى عدم وجود أي فقدان تقريبًا لنشاط الإنزيم في RNase HII الخاص بـ YEASEN حتى بعد 45 دقيقة من التسخين.
الشكل 5. اختبار مقاومة الحرارة 95 درجة مئوية
3. لا يوجد إكسونوكلياز، أو إنزيم التكسير، أو بقايا RNase (جرعة 1 وحدة)
عند احتضان وحدة واحدة من دفعات مختلفة من RNase HII مع ركائزها الخاصة DNA/RNA عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات، أشارت نتائج الرحلان الكهربائي للهلام الأجاروزي إلى عدم وجود أي نوكلياز خارجي أو إنزيم نكش أو بقايا RNase في RNase HII.
الشكل 6.نتائج الكشف عن النوكلياز الخارجي، وإنزيم النكد، وبقايا الريبونوكلياز
المنتجات ذات الصلة الموصى بها
| تطبيق المنتج | اسم المنتج | رقم الكتالوج |
| rhPCR، LAMP | 14539ES 14541ES | |
| تفاعل البوليميراز المتسلسل الريبي | 10101ES | |
| مصباح RT | 14402ES | |
| 11111ES |
مراجع
[1] Dobosy JR، Rose SD، Beltz KR، Rupp SM، Powers KM، Behlke MA، Walder JA. تفاعل البوليميراز المتسلسل المعتمد على RNase H (rhPCR): تحسين الخصوصية والكشف عن تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة باستخدام بادئات قابلة للانقسام محظورة. BMC Biotechnol. 10 أغسطس 2011؛ 11:80. doi: 10.1186/1472-6750-11-80.
[2] Du WF، Ge JH، Li JJ، وآخرون. الكشف عن طفرة نوكليوتيد مفردة عالية الخصوصية بخطوة واحدة عن طريق التضخيم الحراري الوسيط بحلقة تنشيط البادئ (PA-LAMP) [J].Analytica chimica acta، 2019 (1050-): 1050.DOI: 10.1016/j.aca.2018.10.068.