مع التطور السريع لبحوث البروتينات السكرية والأدوية المضادة، اجتذب تعديل الجليكوزيل أيضًا الكثير من الاهتمام. يتم إكمال الاتصال بين الخلايا والخلايا، وبين الخلايا ومسببات الأمراض بشكل أساسي من خلال تفاعل السكريات والبروتينات، ويحدد الجليكوزيل خصائص التصاق الجليكوزل. في IgG، يعد الجليكوزيل المرتبط بالنيتروجين المحفوظ في Asn297 في منطقة Fc أمرًا بالغ الأهمية لنشاطه. بالإضافة إلى ذلك، تحتوي بعض الأجسام المضادة أيضًا على N-glycans إضافية، والتي تؤثر، جنبًا إلى جنب مع الموقع المحفوظ في Asn297 في منطقة Fc، على التعرف ونصف العمر والاستجابة المناعية للجسم المضاد.
إن جليكوزيل البروتين هو تعديل معقد بعد الترجمة يتضمن ربط سلاسل الجليكان في مواقع محددة على البروتينات. اعتمادًا على نوع سلسلة الجليكان، تنقسم الجليكوبروتينات إلى جليكوبروتينات مرتبطة بالنيتروجين، وجليكوبروتينات مرتبطة بالأوكسجين، وما إلى ذلك؛ علاوة على ذلك، يتأثر جليكوزيل البروتين أيضًا بنوع الخلية المضيفة وظروف التخمير (مثل وسط الثقافة، وقيمة الرقم الهيدروجيني، ودرجة الحرارة، وما إلى ذلك). لذلك، عادةً ما يكون للجليكوبروتينات تباين في أنماط الجليكوزيل، بما في ذلك مواقع الجليكوزيل، ومستويات الجليكوزيل، والبنية المحددة لسلاسل الجليكان، مما يجعل تحليل سلسلة الجليكان وتوصيف البنية عملاً صعبًا للغاية. للحصول على أقصى قدر من المعلومات البنيوية لسلسلة الجليكان، فإن الاستراتيجية الرئيسية لتحليل سلسلة الجليكان هي أولاً تحرير سلاسل الجليكان من البروتينات ثم إجراء تحليل وتوصيف مفصلين. في هذه الاستراتيجية، تعد طريقة إزالة الجليكان الفعالة والدقيقة والمستقرة أمرًا بالغ الأهمية.
تُستخدم الطرق الأنزيمية حاليًا على نطاق واسع لإزالة الجليكوزيل.
يمكن تصنيف البروتينات السكرية إلى ببتيدات سكرية مرتبطة بالنيتروجين وببتيدات سكرية مرتبطة بالأوكسجين بناءً على أنواع سلاسل الجليكان الخاصة بها. بالنسبة للببتيدات السكرية المرتبطة بالنيتروجين، تشمل الإنزيمات المستخدمة بشكل شائع الببتيد N-glycosidase F (PNGase F) والإندوغليكوزيداز H (Endo H) والإندوغليكوزيداز S (Endo S). يقوم PNGase F بتحليل رابطة GlcNAc-Asn ويمكنه إزالة سلاسل الجليكان عالية المانوز والمعقدة والهجينة. يشق Endo H الروابط السكرية داخل قلب خماسي السكاريد في سلسلة N-glycan. يشق Endo S على وجه التحديد الجليكانات المرتبطة بالنيتروجين من قلب الكيتوبيوس للسلسلة الثقيلة من IgG الأصلي.
الشكل 1. موقع القطع لـ PNGase F وEndo H وEndo S.
ومن بينهم PNGase F هي الطريقة الأنزيمية الأكثر فعالية لإزالة جميع المواد المرتبطة بالنيتروجين تقريبًا السكريات القليلة التسكر في الجليكوبروتينات، والتي يمكنها أن تشق جليكوبروتينات قليلة التسكر عالية المانوز، والهجينة، والمعقدة المرتبطة بالأسباراجين، على وجه التحديد إزالة الجليكانات المرتبطة بالنيتروجين. موقع الانقسام هو: الرابطة الأميدية بين N-acetylglucosamine الداخلي (GlcNAc) وبقايا الأسباراجين، أثناء تحويل الأسباراجين الموجود على البروتين بعد التحلل الأنزيمي إلى حمض الأسبارتيك.
عندما يقع فوكوز α1-6 في قلب GlcNAc، يمكن لـ PNGase F أيضًا القطع؛ فقط عندما يقع فوكوز α1-3 في قلب GlcNAc (شائع في جليكوبروتينات النباتات والحشرات)، لا يمكن لـ PNGase F القطع.
ومع ذلك، فإن التفاعل الأنزيمي التقليدي لإنزيم PNGase F يتطلب عدة ساعات لإطلاق جليكانات N-الأجسام المضادة، وبسبب تفضيل إطلاق الجليكانات، قد يؤدي عدم اكتمال عملية إزالة الجليكوزيل إلى نتائج متحيزة، وقد لا يمثل توزيع الجليكان الناتج التركيب الصحيح للأجسام المضادة العلاجية. لذلك، فإن الحصول على ملف تعريف دقيق لجليكانات N-الأجسام المضادة في أسرع وقت ممكن أمر بالغ الأهمية لمراقبة عملية إزالة الجليكوزيل أثناء عملية إنتاج الأجسام المضادة وبروتينات اندماج الأجسام المضادة وغيرها من العوامل العلاجية الحيوية.
PNGase F سريع
Fast PNGase F هو كاشف مُعاد التركيب مُحسَّن يمكنه إزالة الجليكوزيلات من الأجسام المضادة والغلوبولينات المناعية والبروتينات المندمجة والجليكوبروتينات الأخرى بسرعة وبشكل كامل في بضع دقائق. يمكن لهذا الإنزيم إزالة جميع الجليكوزيلات بسرعة ودون تفضيل ويمكن استخدامه مباشرة لتحليل الكروماتوغرافيا اللاحقة أو مطياف الكتلة. يبسط Yeasen Fast PNGase F، N-glycosidase F (الإصدار السريع) العملية التجريبية، مما يقلل من وقت التجربة مع ضمان الحساسية والقدرة على التكرار.
مميزات المنتج:
سريع: إزالة الجليكوزيل بشكل كامل وسريع في بضع دقائق.
نقاء عالي: لا تلوث بالبروتياز أو الجليكوسيداز، نقاء ≥95%.
غير انتقائي: قم بإزالة جميع N-glycans بسرعة ودون تفضيل.
التوافق الجيد: يتم استخدامه مباشرة لتحليل الكروماتوغرافيا اللاحقة أو تحليل مطياف الكتلة.
بيانات الاختبار:
إزالة الجليكوزيل من البروتين في خطوة واحدة:
- 10 ميكروجرام من الركيزة/100 ميكروجرام من الجسم المضاد وddH2O مخلوطتان بحجم إجمالي قدره 16 ميكرولتر؛
- أضف 4 ميكرولتر من Fast PNGase F Buffer (5x)، الحجم النهائي 20 ميكرولتر؛
- أضف 1 ميكرولترًا من Fast PNGase F.
- حضنها عند درجة حرارة 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
الشكل 2. تأثير الانقسام الأنزيمي بخطوة واحدة على الركيزة البروتينية (أ) والأجسام المضادة (ب).
1: بروتين MarkerCat#20350ES) 2: منافس + ركيزة أو جسم مضاد 3: منافس + ركيزة أو جسم مضاد 4: Yeasen Fast PNGase F 5: Yeasen Fast PNGase F6: الركيزة أو الجسم المضاد 7: Yeasen Fast PNGase F 8: المنافس
إزالة الجليكوزيل من البروتين في خطوتين:
- 10 ميكروجرام من الركيزة/100 ميكروجرام من الجسم المضاد وddH2O مخلوطتان بحجم إجمالي قدره 16 ميكرولتر؛
- أضف 4 ميكرولتر من Fast PNGase F Buffer (5x)، الحجم النهائي 20 ميكرولتر؛
- حضنها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة دقيقتين، ثم تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
- أضف 1 ميكرولترًا من Fast PNGase F.
- حضنها عند درجة حرارة 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
الشكل 3. تأثير الانقسام الأنزيمي ثنائي الخطو على الركيزة البروتينية (أ) والأجسام المضادة (ب).
1: بروتين MarkerCat#20350ES) 2: منافس + ركيزة أو جسم مضاد 3: منافس + ركيزة أو جسم مضاد 4: Yeasen Fast PNGase F 5: Yeasen Fast PNGase F6: الركيزة أو الجسم المضاد 7: Yeasen Fast PNGase F 8: المنافس
خاتمة:
- يتمتع Yeasen Fast PNGase F بكفاءة انقسام إنزيمية مماثلة أو أعلى من المنافسين المستوردين في ظل نفس ظروف التفاعل؛
- يوصى بإجراء انقسام إنزيمي من خطوتين لضمان كفاءة انقسام إنزيمية أعلى. تتطلب بعض الأجسام المضادة (مثل Fab N-glycosylation) خطوة تسخين مسبق
لإزالة الجليكوزيل بكفاءة.
بالإضافة إلى ذلك، ييسن كما يوفر PNGase F (Cat#20407ES، النشاط النوعي: 100000 وحدة/مل) وأنواع أخرى من الجليكوسيدات، مثل Endo H glycosidase H (Cat#20414ES)، وEndo S glycosidase S (Cat#20413ES).
دليل الشراء
| لون المنتج | 20406ES | 20407ES | 20414ES | 20413ES |
| اسم المنتج | سريع PNGase F | PNGase F | إندو هـ | إندو إس |
| مصدر | التعبير عن الخميرة المعاد تركيبها | التعبير عن الخميرة المعاد تركيبها | التعبير عن الخميرة المعاد تركيبها | الإشريكية القولونية التعبير المؤتلف |
| نشاط محدد | غير قابل للتطبيق | 100000 وحدة/مل | 1000000 وحدة/مل | 8000 وحدة/ملجم |
| موقع الانقسام | تقريبا جميع الجليكان المرتبطة بالنيتروجين | تقريبا جميع الجليكان المرتبطة بالنيتروجين | جليكانات مانوز عالية مرتبطة بالنيتروجين | ينقسم داخل بنية ثنائي السكاريد الأساسية للسلسلة الثقيلة IgG |
| وقت الهضم | 10 دقيقة | 1-3 ساعات | 1-3 ساعات | 1 ساعة |
| الغليكوزيل | مناسب | مناسب | مناسب | مناسب |
| بنية البروتين | مناسب | مناسب | مناسب | مناسب |
معلومات الطلب
| اسم المنتج | رقم المنتج | مواصفة |
| 20406ES20/50 | 20 طن/50 طن | |
| 20407ES01/02 | 15000 وحدة / 75000 وحدة | |
| 20414ES92/97 | 10000 وحدة / 50000 وحدة | |
| 20413ES80/90 | 1000 وحدة/5 × 1000 وحدة |