عندما يتعلق الأمر بالتيلوميرات والبروتيلوميريز في علم الأحياء، غالبًا ما يفكر الناس أولاً في الشيخوخة، وهي ظاهرة طبيعية لا مفر منها. التيلوميرات يكون تسلسلات DNA المتكررة في نهايات الكروموسومات حقيقية النواة، والتي تحمل مسؤولية الحفاظ على سلامة الكروموسومات وتنظيم دورة انقسام الخلية.
بروتيلوميراز هو إنزيم عكسي لتخليق الحمض النووي يعمل على إطالة التيلوميرات. وهو عبارة عن نوكليوبروتين يتكون من الحمض النووي الريبي والبروتينات. يمكن للمكون البروتيني تحفيز تخليق تسلسلات تكرار التيلومير مع مكون الحمض النووي الريبي.
الشكل 1. آلية امتداد التيلومير بوساطة البروتيلوميراز[1]
بروتيلوميراز يمكن أن تعمل هذه التقنية على إصلاح التيلوميرات وإطالتها، وتعويض العيوب في تكرار الحمض النووي، ومنع فقدان التيلوميرات أثناء انقسام الخلايا، وزيادة عدد انقسامات الخلايا. في عام 2009، مُنحت جائزة نوبل في الفسيولوجيا أو الطب إلى إليزابيث إتش بلاكبيرن، وكارول دبليو جرايدر، وجاك دبليو زوستاك لمساهماتهم البارزة في الكشف عن الدور الحاسم للتيلوميرات والبروتيلوميراز. في وظيفة الخلية والشيخوخة.
اليوم، أريد أن أقدم لكم بروتيلوميراز فريد من نوعه: بروتيلوميراز TelN. يأتي من البكتيريا العاثية N15 وهو أحد مكونات نظام تكرار N15، ويشارك في توليد الحمض النووي الخطي للبكتيريا الطلائية. على عكس البروتيلوميراز في حقيقيات النوى، يعتبر TelN إنزيمًا بروتينيًا نقيًا بدون أي مكونات RNA. لديه خاصية الانقسام والربط النشاط ويترك نهاية مغلقة تساهميًا في موقع الانقسام بعد قطع الحمض النووي مزدوج السلسلة (dsDNA).
الشكل 2. بروتيلوميراز TelN موقع الانقسام
بروتيلوميريز تلين آلية العمل
موقع التعرف على بروتيلوميريز TelN هو تسلسل متناظر طوله 56 زوجًا قاعديًا، مع telR وtelL على كلا الجانبين. الموضع المركزي للتسلسل المستهدف هو أيضًا تسلسل متناظر telO. بروتيلوميريز TelN ينشطر داخل تسلسل telO ويشكل بنية دبوس الشعر المغلقة تساهميًا عند طرفي الانقسام. لا تزال نهاية الحمض النووي بعد الهضم تتكون من telR وtelL، والمعروفة باسم عظمة الكلب الحمض النووي (dbDNA).
الشكل 3. بروتيلوميراز آلية الانقسام في موقع TelN[2]
بسبب نشاط الانقسام الإنزيمي الخاص لإنزيم بروتيلوميريز تلين، يمكن تحويل الحمض النووي البلازميدي الدائري إلى جزيئات خطية مغلقة تساهميًا على شكل دمبل من خلال تفاعل إنزيمي من خطوة واحدة. بالمقارنة مع جزيئات الحمض النووي الخطية المفتوحة، فإن الحمض النووي الخطي المغلق لديه مستوى تعبير بروتيني أعلى في الخلايا، وهو مناسب جدًا لبناء الحمض النووي الخطي المصغر المغلق الطرف مع استقرار عالٍ وتسلسل غريب ضئيل. يلعب الحمض النووي البلازميدي دورًا حيويًا كعنصر أساسي في لقاح mRNA ولقاح الحمض النووي وعلاج الجينات الخلوية. تتضمن طريقة إنتاج البلازميد التقليدية التخمير باستخدام الإشريكية القولونية والتضخيم متعدد المراحل، والمخاطر التي لا يمكن السيطرة عليها في عملية التخمير تحد من إنتاج البلازميد عالي الجودة، والذي يصبح المفتاح للحد من القدرة الإنتاجية للقاحات. أطلقت شركة Touchlight في المملكة المتحدة تقنية dbDNA المبتكرة. تعطل هذه التقنية الطريقة التقليدية للتخمير البكتيري لإعداد DNA البلازميدي وبدلاً من استخدام التخليق الأنزيمي للحمض النووي في المختبر. يتم أيضًا استخدام نشاط الانقسام الإنزيمي الخاص لـ TelN Protelomerase لتوليد DNA صغير مغلق النهاية في الطريقة المذكورة أعلاه.
استخدام بروتيلوميريز TelN في التخليق الأنزيمي للحمض النووي
يمكن للطريقة الأنزيمية لتخليق الحمض النووي في المختبر القائمة على بوليميراز الحمض النووي phi29 وبروتيلوميراز TelN تجنب العديد من المخاطر التي لا يمكن السيطرة عليها في عملية التخمير البيولوجي، ويمكن للطريقة الأنزيمية في المختبر تخليق الحمض النووي بسرعة عالية وإنتاجية عالية. يمكن استخدام الحمض النووي المخلوط في العديد من التقنيات الناشئة، مثل لقاح mRNA ولقاح الحمض النووي وناقل العلاج الجيني وتحرير الجينات.
الشكل 4. مخطط انسيابي لتخليق الحمض النووي بواسطة الأنزيم[3]
عملية تخليق الحمض النووي الأنزيمي
- تشويه القالب
يتم تحويل قالب DNA البلازميدي الدائري إلى اثنين من DNA الدائرية أحادية السلسلة من خلال عملية التحلل.
- تضخيم الدائرة المتدحرجة
تم إجراء تضخيم الدائرة المتدحرجة باستخدام بوليميراز الحمض النووي Phi29 والحمض النووي الدائري أحادي السلسلة لتوليد الحمض النووي المزدوج السلسلة الخطي الطويل مع فترات تسلسل التعرف على البروتيلوميراز.
- القطع والإغلاق التساهمي
يتعرف بروتيلوميريز TelN على telRL على الحمض النووي للمركبات التيلوميرية، ويقوم بأنشطة الانقسام والربط لتوليد مونومرات الحمض النووي المتصلة تساهميًا خطيًا.
- إزالة الحمض النووي للعمود الفقري للبكتيريا
تعمل نوكليازات القيد أو نوكليازات التكسير على تحلل الحمض النووي للهيكل البكتيري ببنية مفتوحة في النهاية للحصول على الحمض النووي الذي يحتوي فقط على عناصر التعبير الجيني المستهدفة. يتجاوز التخليق الأنزيمي لتقنية الحمض النووي التخمير البيولوجي ويمكنه تحقيق تخليق الحمض النووي البلازميدي بسرعة على مستوى GMP، مما يحل قيود القدرة الإنتاجية في مجالات العلاج الجيني ولقاحات mRNA. إنه يحمل إمكانات هائلة للتصنيع. لتعزيز تطوير تقنية التخليق الأنزيمي للحمض النووي، يمكن لشركة YEASEN Biology توفير مواد إنزيمية أساسية للتخليق الأنزيمي للحمض النووي، مثل بوليميراز الحمض النووي phi29 (14404ES) وبروتيلوميراز TelN (14540ES)، للمساعدة في البحث وإنتاج تقنية التخليق الأنزيمي للحمض النووي.
صعرض الأداء من YEASEN بروتيلوميريز تلين
- أداء الانقسام والربط ممتاز، وهو ما يعادل العلامات التجارية المستوردة.
باستخدام بلازميد فائق الالتواء يحتوي على موقع التعرف على بروتيلوميريز TelN كقالب، تمت إضافة إنزيم الإضافة المتدرج (0.078-5 وحدة) من YEASEN والعلامة التجارية A. تم تحويل 0.5 ميكروجرام من البلازميد فائق الالتواء إلى DNA مزدوج السلسلة خطي مغلق (dsDNA). تم استخدام الرحلان الكهربائي للهلام للكشف عن كفاءة التحويل، وأظهرت النتائج أن نشاط الانقسام والربط لإنزيم بروتيلوميريز TelN من YEASEN كان معادلاً لنشاط العلامة التجارية A.
الشكل 5. الكشف عن نشاط انقسام البروتيلوميراز لـ TelN M:Marker، C: التحكم في البلازميد الفائق الالتواء
- سلامة إغلاق الحمض النووي الخطي ثنائي السلسلة > 90%
باستخدام البلازميد الملفوف للغاية الذي يحتوي على موقع التعرف على إنزيم بروتيلوميريز TelN كقالب، وإضافة إنزيم بروتيلوميريز TelN من YEASEN والعلامة التجارية A، وتحويل 0.5 ميكروجرام من البلازميد الملفوف للغاية إلى dsDNA خطي مغلق، وإضافة إكسونوكلياز T5 للكشف عن سلامة نهايته من خلال درجة تدهور النطاق. أظهرت النتائج أن سلامة إغلاق نهاية dsDNA الناتج عن إنزيم بروتيلوميريز TleN من YEASEN كانت > 90%، وهو ما يعادل سلامة العلامة التجارية A.
الشكل 6. اختبار سلامة إغلاق نهاية بروتيلوميراز TelN. C1: بلازميد يحتوي على موقع التعرف على TelN، بدون بروتيلوميراز TelN؛ C2: بلازميد يحتوي على موقع التعرف على TelN، بروتيلوميراز TelN، بدون إكسونوكلياز T5؛ بلازميد: بلازميد يحتوي على موقع التعرف على TelN.
المنتجات ذات الصلة ل التخليق الأنزيمي للحمض النووي
| تصنيف المنتج | اسم المنتج | رقم الكتالوج |
| بروتيلوميراز | 14540ES | |
| بوليميراز الحمض النووي Phi29 | 14404ES | |
| إكسونوكلياز | إكسونوكلياز III | 14525ES |
| 14538ES | ||
| دي إن تي بي | 10125ES |
رالمراجع
[1] جيارديني إم إيه، سيجاتو إم، دا سيلفا إم إس، نونيس في إس، كانو إم آي. التيلومير والبروتيلوميراز علم الأحياء. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014؛ 125: 1-40.
[2] Heinrich J، Schultz J، Bosse M، Ziegelin G، Lanka E، Moelling K. DNA الخطي المصغر المغلق الناتج عن إنزيم الربط بين الخلايا البدائية TelN له وظيفة في الخلايا الثديية. J Mol Med (Berl). 2002؛80(10):648-654.
[3] Heinrich J، Schultz J، Bosse M، Ziegelin G، Lanka E، Moelling K. الحمض النووي الصغير الخطي المغلق الناتج عن إنزيم الربط بين الخلايا البدائية TelN له وظيفة في الخلايا الثديية. J Mol Med (Berl). 2002؛ 80 (10): 648-654. doi:10.1007/s00109-002-0362-2.