تطور وأهمية هياكل CAP في تقنية مرنا

إن بنية Cap هي عنصر أساسي في تطوير لقاحات mRNA والعلاجات. تعتمد تقنية mRNA الاصطناعية على Cap1 لتعزيز الاستقرار وكفاءة الترجمة وتقليل التعرف المناعي الفطري على mRNA بواسطة مستقبلات TLRs (TLRs) وأجهزة الاستشعار المناعية الأخرى، مما يقلل من التنشيط المناعي غير المرغوب فيه. وهذا يمنع الاستجابات الالتهابية غير المرغوب فيها، وبالتالي تحسين استقرار وفعالية mRNA العلاجي في الخلايا البشرية.

الاكتشاف المبكر وبنية Cap0

في منتصف سبعينيات القرن العشرين، كشفت الأبحاث التي أجريت على mRNA حقيقية النواة عن بنية طرفية 5' تُعرف الآن باسم Cap0، حيث يتم ربط غطاء N7-methylguanosine (m7G) بالنوكليوتيد الأول عند الطرف 5'. وقد وجد أن هذا التعديل يحمي mRNA من التحلل بواسطة النوكليازات الخارجية، ويساعد في التصدير النووي، ويعزز التعرف على الريبوسوم لبدء الترجمة. كان Cap0 أول بنية غطاء مميزة، حيث اقتصر مثيلته على غطاء الغوانوزين نفسه. كان اكتشاف هذا الغطاء 5' ووظائفه بمثابة تقدم كبير في فهم أغطية mRNA حقيقية النواة ودورها في تعديلات mRNA.

Cap0 Structure

ظهور Cap1

تلعب بنية Cap1، وهي سمة أساسية من سمات mRNA حقيقية النواة، دورًا محوريًا في استقرار mRNA والترجمة والتعرف المناعي. تطورت بنية غطاء mRNA، التي تتكون من N7-methylguanosine (m7G) المرتبط بالنوكليوتيد الأول عبر رابط ثلاثي الفوسفات 5'-5'، من الدراسات المبكرة حول التعديلات اللاحقة للنسخ في mRNA حقيقية النواة في سبعينيات القرن العشرين.

Cap1 Structure

[1] كشفت التحقيقات الإضافية أنه في معظم الرنا المرسال حقيقيات النوى، يتم أيضًا مثيلة النوكليوتيد الأول الذي يلي الغطاء (الموضع +1) عند موضع 2'-O في الريبوز، وهي العملية المعروفة باسم مثيلة 2'-O. أضاف هذا الاكتشاف، المعروف باسم بنية Cap1 (m7GpppNm)، طبقة أخرى من الأهمية الوظيفية لتعديلات mRNA. وجد أن تعديل Cap1 يضبط استقرار mRNA ويمنع التعرف المناعي من قبل الجهاز المناعي الفطري، وخاصة في الخلايا الثديية، حيث يساعد في التهرب من التعرف من قبل مستقبلات التعرف على الأنماط مثل RIG-I وTLRs وMDA5【2】. كان هذا أمرًا بالغ الأهمية لكل من استقلاب mRNA وتقدم التقنيات القائمة على mRNA، بما في ذلك تطعيم mRNA وتطبيقات العلاج الجيني.

التحديات التقنية في صناعة mRNA والحلول الحالية

لا تزال هناك العديد من التحديات الفنية التي تواجه الاستخدام الواسع النطاق للقاحات mRNA وتحسينها، بما في ذلك المشكلات المتعلقة بجرعات mRNA العالية، والاستجابات المناعية، والاستقرار، والتوصيل. ويتمثل أحد التحديات الكبيرة في صناعة mRNA في الحاجة إلى جرعات عالية من mRNA لاستحضار استجابة مناعية قوية. ويرجع هذا إلى عدة عوامل:

التدهور السريع: يعتبر mRNA غير مستقر بطبيعته وعرضة للتدهور عن طريق إزالة الأغطية من الإنزيمات والريبونوكليازات (RNases) الموجودة في الأنظمة البيولوجية.

كفاءة الترجمة المحدودة: قد تتفاوت كفاءة ترجمة mRNA إلى بروتين، مما يتطلب كميات أكبر من mRNA لتوليد مستويات كافية من المستضد للاستجابة المناعية. ترتبط كفاءة الترجمة بتقارب Cap1 وعامل بدء الترجمة eIF4E.

Translation Initiation Complex

تكوين مجمع بدء الترجمة الأساسي في حقيقيات النوى.【3】

المناعة وردود الفعل المناعية غير المرغوب فيها: إن العقبة الثالثة الأكبر هي الاستجابة المناعية الفطرية التي يمكن أن تحفزها mRNA نفسها، وخاصة بالنسبة لـ dsRNA أو mRNA غير المكتمل. وفي حين أن مستوى معينًا من التنشيط المناعي مطلوب لتحفيز الجهاز المناعي التكيفي، فإن التنشيط المفرط يمكن أن يؤدي إلى استجابات التهابية، مما قد يقلل من فعالية اللقاح أو يسبب آثارًا جانبية.

تاريخ تكنولوجيا التغطية

  1. تكنولوجيا التغطية الأنزيمية: تتضمن عملية التغطية الأنزيمية، التي تم تقديمها في الأيام الأولى لأبحاث mRNA، استخدام إنزيمات التغطية مثل guanylyltransferase وmethyltransferase لإضافة غطاء 5' طبيعي بعد النسخ. تضمن هذه الطريقة دقة عالية وكفاءة تغطية في ترجمة mRNA، وخاصة للتطبيقات العلاجية.

  2. نظائر الأغطية الاصطناعية (1980-2000): طور الباحثون نظائر غطاء اصطناعية لتخليق mRNA المغطى في المختبر، مما يساعد في دراسة وظيفة mRNA والتعبير الجيني. إن نظائر الغطاء المضادة للعكس (ARCA) هي نظائر غطاء اصطناعية مصممة لمنع دمج الغطاء بشكل غير صحيح أثناء تخليق mRNA، مما يحسن كفاءة ترجمة mRNA للقاحات والعلاجات الجينية. ومع ذلك، فإن كفاءة الغطاء وعائد أغطية ARCA منخفضة.

  3. تكنولوجيا Cap1 (2010): إن Cap1 من TriLink هي طريقة تغطية مشتركة للنسخ تعمل على تبسيط العملية من خلال دمج الغطاء مباشرة أثناء تخليق mRNA. تعمل هذه الطريقة على تعزيز الكفاءة وتنتج نسبة عالية من mRNA المغطى بشكل صحيح، مما يجعلها مثالية للتطبيقات العلاجية واسعة النطاق مثل لقاحات mRNA.

في الوقت الحالي، كانت تقنيات التغطية الأنزيمية حاسمة في تطوير العلاجات القائمة على mRNA، بما في ذلك لقاحات COVID-19، مما يضمن استقرار وترجمة mRNA العلاجية بشكل فعال.

مقارنة التغطية الأنزيمية للجيل القادم تغطية LZCap وطريقة التغطية من الجيل الأول (ARCA)


تطوير الجيل القادم من نظائر الأغطية

هدفنا هو تطوير نظائر الغطاء ذات المقاومة لإنزيمات إزالة الغطاء، وذات تقارب كبير مع eIF4E لتحسين كفاءة الترجمة، وخفض المناعة. هذه التطورات ضرورية لتعزيز فعالية العلاجات القائمة على mRNA، بما في ذلك علاجات مكافحة السرطان وتطبيقات العلاج الجيني.

تصميم LZCap

في تصميم LZCap، ركزنا بشكل أساسي على إنشاء نظير للغطاء ذو ​​تقارب عالٍ مع eIF4E. تتمتع الإنزيمات بتعرف "محدد" نسبيًا على الركائز. لذلك، عند تصميم بنية غطاء جديدة، نسعى جاهدين للحفاظ على التشابه مع الهياكل الطبيعية/المعروفة قدر الإمكان. تحتوي البنية الطبيعية على 3'OH من الريبوز، والتي يمكن تعديلها (على سبيل المثال، الميثلة). بناءً على هذا الاعتبار، اخترنا إضافة ذرة كربون في الموضع 3' للتجديد، متبوعة بـ NH لمحاكاة الرابطة الهيدروجينية لـ OH، ثم مجموعة أسيتيل لتقليل قاعدية NH وتعزيز قدرتها على الارتباط بالهيدروجين. إن نشاط LZCap أفضل من الغطاء الطبيعي الميثيلي، ربما بسبب زيادة الرابطة الهيدروجينية. بالمقارنة مع مجموعات الميثيل والميثوكسي، قد تزيد مجموعة أمين الأسيتيل أيضًا من تفاعلات فان دير فال بين الركيزة (الغطاء) وعامل البدء (الإنزيم).

استقرار مجموعة الأسيتيل الأمينية

إن مجموعة الأمين الأسيتيل مستقرة بدرجة كافية بالفعل. وهي أكثر استقرارًا بكثير من الموضع الميثيلي 7 والرابطة الفوسفوديسترية، وهما أقل أجزاء الغطاء استقرارًا.

العائد وكفاءة التغطية لـ LZCap

مع غطاء LZCap AG(3'Acm)، تبلغ كفاءة تغطية mRNA للوسيفيراز حوالي 97.59%، ويمكن الحصول على ما يصل إلى 200 ميكروجرام من mRNA المغطى باستخدام قالب DNA 1 ميكروجرام في تفاعل نسخ قياسي في المختبر (IVT) مع بوليميراز RNA T7. تصل نقاء mRNA إلى 99% بعد ترسيب LiCl البسيط. تجعل كفاءة التغطية العالية هذه وعائدها من LZCap خيارًا جذابًا لتطبيقات مختلفة، بما في ذلك إنتاج البروتين والعلاج الجيني.

يشكل هيكل الغطاء عنصرًا أساسيًا في تطوير لقاحات وعلاجات mRNA.تعتمد تقنية mRNA الاصطناعية على Cap1 لتعزيز الاستقرار وكفاءة الترجمة وتقليل التعرف المناعي الفطري على mRNA بواسطة مستقبلات TLRs وغيرها من أجهزة الاستشعار المناعية، مما يقلل من التنشيط المناعي غير المرغوب فيه. وهذا يمنع الاستجابات الالتهابية غير المرغوب فيها، وبالتالي تحسين استقرار وفعالية mRNA العلاجي في الخلايا البشرية.

منتج

كاب ايه جي (3'-اميثيل-7 ميكروجرام)

إل زد كاب AG(3'Acm)

ايه جي (لا يوجد حد أقصى)

إنتاج mRNA (ميكروجرام)

164

173

200

تحليل MS لكفاءة التغطية لـ LZCapped Luciferase mRNA باستخدام طريقة تعتمد على RNAse H. كفاءة التغطية حوالي 97.59%،

ما مدى استقرار mRNA تجاه إنزيم إزالة الغطاء؟

تظهر mRNAs مع LZCap AG(3'Acm) وLZCap AG M6 (3'Acm) مقاومة أعلى تجاه إنزيم نزع الغطاء (NEB). تجدر الإشارة إلى أن CapM6 (3'-OMe-6mA-7mG) مقاوم أيضًا لإنزيم نزع الغطاء، لكن Cap AG العادي (3'-OMe-7mG) لا يظهر المقاومة.

ما هي درجة ارتباط LZCap بـ eIF4E؟

ماذا عن التعبير البروتيني لـ LZCap AG(3'Acm) المغطى بـ mRNA؟

إن التعبير عن mRNA المغطى للوسيفيراز LZCap AG(3'Acm) أعلى بشكل ملحوظ من التعبير عن mRNA المغطى لـ Cap1 (3'-OMe-7mG) في خطوط الخلايا المختلفة* (3T3-L1، Hela، JAWs، HEK293T وHuh7)، وقد أظهرت تجربة التكرار 130 مرة تعبيرًا أعلى بنحو 1.5 مرة عن mRNA المغطى للوسيفيراز LZCap AG(3'Acm) من mRNA المغطى (3'-OMe-7mG) في المتوسط. وقد لوحظت نتيجة مماثلة في الفئران. قد يختلف مستوى التعبير البروتيني قليلاً مع تسلسل mRNA المختلف.

هل لديك المزيد من البيانات الحيوانية؟

كفاءة التعبير عن LZCap AG(3'Acm) أو LZCap AG(3'FMom) المغطى

يظهر ترميز GLuc لـ mRNA تعبيرًا أعلى في الجسم الحي مقارنةً بـ mRNA المغطاة بـ CapAG (3'-OMe-7mG) في قرد Cynomolgus والخنزير.

ماذا عن المناعة الفطرية لـ mRNAs المغطاة بـ LZCap AG؟

تظهر mRNAs المغطاة بـ LZCapAG (3'Acm) مناعة فطرية منخفضة. تلعب TLR8 وTLR7 وIL-1A وB دورًا مهمًا في الاستجابة المناعية التي يسببها RNA غير المغطى. أظهرت الدراسات الحية لتحليل مناعة mRNA المغطاة بـ LZCap أن RNA غير المغطى تسبب في تغييرات كبيرة في مستوى نسخ العوامل المرتبطة بالمناعة في الفئران. يظهر كل من mRNAs المغطاة بـ LZCap و3'-OMe-7mG مستوى نسخ أقل مماثل لعوامل المناعة في الفئران بعد حقنة واحدة محفزة بـ RNA.

هل قمت ببعض اختبارات السلامة؟

نعم، لقد أجرينا اختبار السمية الخلوية، ودراسة تثبيط البوليميراز البشري واختبار أميس.

  1. لم يتم ملاحظة أي سمية خلوية أو سمية قليلة لمونومر النوكليوسيد من 3'-Acm-7mG (CC50> 10000nM) في خلايا 293T وHuh7 وMRC5 وTHP1 وU87MG.
  2. بوليميريز الحمض النووي البشري ( α ,β , غاما وتظهر دراسات تثبيط نشاط بوليميراز الحمض النووي الريبي للميتوكوندريا (hPOLRMT) و (Klenow) أن 3'-Acm-7mG TP لا يثبط بوليميراز الحمض النووي البشري أو الحمض النووي الريبي.
  3. يكشف اختبار الطفرة العكسية للبكتيريا (Ames) عن التغيرات الجينية المرتبطة، وكذلك المواد المسرطنة السامة للجينات في معظم القوارض والبشر. أظهر اختبار Ames أن 3'-Acm-7mG ليس له أي سمية جينية.

هل تم تسجيل براءة اختراع لهذا المنتج؟

نعم، تم منح براءة الاختراع في الولايات المتحدة.

معلومات الطلب

اسم المنتج تحديد رقم الكتالوج
إل زد كاب AG(3'Acm)（ (100 مليمول) 100 ميكرولتر، 1 مل 10684ES
إل زد كاب وحدة القياس الفلكي (3'سم)( 100 مليمول) 100 ميكرولتر، 1 مل 10685ES
إل زد كاب GG(3'Acm)（ (100 مليمول) 100 ميكرولتر، 1 مل 10686ES
LZCap AG(3'Ma-Cy5)（ (25 ملم) 100 ميكرولتر، 1 مل 10688ES
إل زد كاب AG(3'Ma-Cy7)( 25 ملم) 100 ميكرولتر، 1 مل 10689ES
LZCap (AG(3'Ma-Cy3) (25 مليمول) 100 ميكرولتر، 1 مل 10687ES
LZCap (AG(3'Ma-البيوتين) (25 ملم) 100 ميكرولتر، 1 مل سؤال
LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 ملم) 100 ميكرولتر، 1 مل سؤال
LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 ملم) 100 ميكرولتر، 1 مل أنااستفسار
LZCap (AG(3'Acm) Firefly luc mRNA (1μg/μL) 100 ميكرولتر، 1 مل أنااستفسار
LZCap (AG(3'Acm) eGFP mRNA (1μg/μL) 100 ميكرولتر، 1 مل أنااستفسار
LZCap (AG(3'Acm) eGFP saRNA (1μg/μL) 100 ميكرولتر، 1 مل أنااستفسار
LZCap (AG(3'Acm) RFP mRNA (1 ميكروجرام/ميكرولتر) 100 ميكرولتر، 1 مل سؤال
LZCap (AG(3'Acm) Cas9 mRNA (1μg/μL) 100 ميكرولتر، 1 مل أنااستفسار
LZCap (AG(3'Acm) Gluc mRNA (1μg/μL) 100 ميكرولتر، 1 مل أنااستفسار

مرجع:

  1. الآليات الجزيئية لتكوين غطاء الحمض النووي الريبي لفيروس كورونا ومثيلته، فيرولوجيكا سينيكا 31(1)
  1. لقاحات mRNA - عصر جديد في علم اللقاحات. قس وطني، اكتشاف المخدرات. 17، 261-279 (2018).
  2. تنظيم بدء الترجمة بواسطة بروتين رابط للحمض النووي الريبي في الثدييات: تعديل مجمع بدء الترجمة بواسطة العوامل المؤثرة عبر الخلايا 2021, 10(7)، 1711

سؤال