تحسين الإنتاج الصناعي وتنقية مرنا التضخيم الذاتي

وعلى الرغم من تحقيق نتائج جيدة خلال الجائحة وإظهار إمكانات كبيرة، لا تزال تقنية mRNA تعاني من العديد من القيود، مثل أوقات التعبير القصيرة وترجمة البروتين المحدودة. وفي حين يمكن لهذه الميزات أن توفر مستوى معينًا من الأمان، فإنها تصبح قيودًا للعلاجات مثل استبدال البروتين. وهذا يتطلب تكرار الجرعات للحفاظ على مستويات التعبير عن البروتين، مما يؤدي إلى مخاطر وتحديات جديدة مثل المناعة والأجسام المضادة المحايدة.

يمكن أن تولد RNA ذاتية التضخيم (saRNA) نفس الاستجابة المناعية عند جرعات أصغر بمئات أو حتى آلاف المرات من mRNA التقليدية. تعني الجرعات المنخفضة انخفاض تكاليف الإنتاج، ويمكن أن تقلل الحقن الأقل تكرارًا من الآثار الجانبية السامة المحتملة من mRNA وناقلات التوصيل. حاليًا، دخلت العديد من مرشحات saRNA التجارب السريرية في جميع أنحاء العالم. تعمل شركات كبرى مثل BioNTech بنشاط على تطوير خطوط أنابيب تقنية saRNA.

على الرغم من أن saRNA يوفر مزايا كبيرة من حيث التكلفة والسلامة، إلا أن بنيته الفريدة تفرض تحديات إنتاجية جديدة. جزيء saRNA، الذي يجمع بين بوليميراز RNA المشفر للتسلسل وتسلسل البروتين المستهدف، أكبر بكثير (~10 كيلو بايت) وأكثر تعقيدًا (يحتوي على المزيد من الهياكل الثانوية) من mRNA التقليدي. وهذا يزيد بشكل كبير من صعوبة تفاعلات النسخ في المختبر، مما يقلل من العائد ونقاء إنتاج saRNA. لذلك، يتطلب إنتاج saRNA معايير أعلى في عمليات التخليق والفصل والتنقية.

إن طريقة الكروماتوغرافيا التقاربية، وهي طريقة تستخدم للفصل والتنقية، تعاني من مشكلات مثل انخفاض إنتاج المنتج المستهدف وسلامته. إن الجمع بين طرق تنقية الكروماتوغرافيا المتعددة (على سبيل المثال، إضافة كروماتوغرافيا السليلوز، وكروماتوغرافيا الطور العكسي الكارهة للماء) أمر مرهق، ويؤدي إلى ظهور شوائب جديدة، ومعدلات استرداد منخفضة، ومكلف. بالإضافة إلى ذلك، فإن نظام تفاعل IVT المستخدم للإنتاج على نطاق واسع مُحسَّن من أنظمة مناسبة لتوليف تسلسلات حمض نووي 100nt، مما يجعله غير مناسب لـ saRNA، الذي يتجاوز حجمه 10 كيلو بايت. وهذا يستلزم تحسين أنظمة تفاعل IVT الحالية. حاليًا، لا تستطيع طرق تنقية mRNA التقليدية تلبية متطلبات جودة السائل الخام الصناعي. لذلك، هناك حاجة ملحة لتطوير وتحسين عملية فصل وتنقية كاملة وفعالة بدرجة صناعية لتضخيم الحمض النووي الريبي ذاتيًا.

تحسين الإنتاج الصناعي وطرق التنقية

لتطوير نظام إنتاج صناعي لتضخيم الرنا المرسال ذاتيًا، من الضروري أولاً تحسين أنواع الأيونات العازلة والمكونات في نظام النسخ المشترك IVT على نطاق صغير. يتضمن هذا أيضًا تحسين نسبة العازلة الكروماتوغرافية وغسيل العينة لعمليات التنقية اللاحقة. يمكن بعد ذلك توسيع نطاق هذه الظروف المحسنة إلى الإنتاج على نطاق واسع للتحقق مما إذا كان النظام قادرًا على زيادة القدرة الإنتاجية بشكل فعال وتحسين جودة المنتج الخام.

نظام تفاعل إضافة الغطاء للنسخ المشترك

في نظام تفاعل إضافة الغطاء للنسخ المشترك، تتضمن مكونات مخزن T7 400 مليمولار من HEPES، و20 مليمولار من سبيرميدين، و100 مليمولار من DTT، وأملاح Mg2+.

T7 Buffer - نوع ملح أيون المغنيسيوم

يؤثر نوع ملح أيون المغنيسيوم المستخدم على العائد وسلامة منتج saRNA المستهدف.

1. بالنسبة لتخليق النسخ المشترك على نطاق صغير لـ 1 ملغ من mRNA، فإن استخدام Mg(OAc)2 كملح Mg2+ يؤدي إلى أفضل إنتاجية وسلامة، بقيم 100.5 ميكروجرام و62.9% على التوالي.
2. في المقابل، فإن استخدام أملاح أيونات المغنيسيوم الأخرى مثل MgCl2 وMgSO4 يقلل من العائد بنحو 25-50% والسلامة بنحو 10%، مما يؤدي إلى انخفاض كبير في كل من العائد والسلامة.

محلول T7 - ​​تركيز أيونات المغنيسيوم

يعمل التركيز الأمثل لأيونات أسيتات المغنيسيوم (30-50 مليمول) على تعزيز إنتاجية وسلامة saRNA المستهدفة، مع أفضل النتائج عند 35 مليمول.

1. عند تركيز أيون أسيتات المغنيسيوم 30-50 مليمول، يصل إنتاج saRNA إلى 88.5-100.5 ميكروجرام، وتكون السلامة 58.6-62.9%، مما يدل على نتائج جيدة.
2. عند تركيز 35 مليمول، يكون العائد والسلامة في أعلى مستوياتهما، حيث يصلان إلى 100.5 ميكروجرام و62.9% على التوالي.

محلول T7 - ​​ملح أيون المغنيسيوم الممزوج بأملاح أخرى

إن إضافة أملاح أخرى إلى محلول T7 يمكن أن يؤدي إلى تحسين إنتاجية المنتج المستهدف وسلامته بشكل كبير.

1. يشتمل محلول T7 الأساسي على 400 مليمولار من HEPES، و20 مليمولار من سبيرميدين، و100 مليمولار من DTT، وأملاح Mg2+، مما يؤدي إلى إنتاجية وسلامة تبلغ 100.5 ميكروجرام و62.9% على التوالي.
2. يؤدي إضافة ملح ثانٍ، NaOAc، إلى تعزيز الغلة والسلامة بشكل أكبر: حيث يزيد الغلة بمقدار 20-110 ميكروجرام، وتتحسن السلامة بنحو 2-8%.

محلول T7 - ​​تركيز الأملاح المركبة

عندما يكون مكون الملح الثاني NaOAc (Na+) عند تركيز 5-30mM، يتحسن إنتاج saRNA المستهدف وسلامته بشكل كبير، مع أفضل تركيز عند 15mM.

1. عند تركيزات Na+ تتراوح من 3 إلى 30 مليمول، يصل إنتاج saRNA إلى 120 إلى 210 ميكروجرام، وتكون السلامة 64.4 إلى 70.2%، مما يُظهر نتائج جيدة.
2. عند تركيز Na+ يبلغ 15mM، يكون العائد والسلامة في أعلى مستوياتهما، حيث يصلان إلى 210 ميكروجرام و70.2% على التوالي.

طرق التنقية الفردية

أثناء إنتاج وتنقية saRNA على نطاق صغير (<50 مجم)، يمكن أن يؤدي استخدام طرق تنقية مختلفة إلى تقليل محتوى dsRNA وبقايا البروتين بشكل كبير، مما يضمن إنتاجية عالية وكفاءة تغطية ونزاهة المنتج. فعالية طرق التنقية من الأفضل إلى الأسوأ هي: كروماتوغرافيا التقارب > ترسيب كلوريد الليثيوم > الترشيح الفائق، كروماتوغرافيا السليلوز.

1. كروماتوغرافيا التقارب

بالنسبة لإنتاج mRNA على نطاق واسع، يفضل استخدام الكروماتوغرافيا. تشمل الخيارات الكروماتوغرافيا العكسية، والتبادل الأيوني، والكروماتوغرافيا الكارهة للماء، والكروماتوغرافيا التآلفية، ولكل منها إيجابياتها وسلبياتها. توفر الكروماتوغرافيا التآلفية، المستخدمة غالبًا لالتقاط mRNA متعدد (A)، حلولاً قابلة للتطوير ومنصة مع معدلات استرداد تزيد عن 90%.

تسهل السمات البنيوية الرئيسية لـ mRNA، وهي الغطاء 5' والذيل متعدد (A) 3'، عملية التنقية. تستخدم كروماتوغرافيا التقارب، المشابهة لتنقية الخرز المغناطيسي، حبات مرتبطة بـ dT لالتقاط mRNA ذي الذيل متعدد (A). تعمل ظروف الملح العالية على حجب الشحنات السالبة، مما يسمح بالارتباط من خلال الروابط الهيدروجينية AT، ويتم إخراج mRNA تحت درجة حموضة معتدلة محايدة وموصلية منخفضة.

تتضمن تقنية كروماتوغرافيا التقارب للحمض النووي الريبي "ارتباطًا عاليًا بالملح وإفراغًا منخفضًا للملح". تؤثر تركيبة العازل وحجم الجزيئات ودرجة الحرارة وتركيز العينة بشكل كبير على العملية. يعد اختيار نوع الملح الأمثل والتركيز من خلال التجربة أمرًا ضروريًا للتنقية الفعالة.

التنقية: تعطي هذه الطريقة أعلى سلامة للمنتج (80.3٪) وأقل محتوى من dsRNA (0.01 ميكروجرام / ملجم) وأعلى كفاءة تغطية (96.4٪) وأقل بقايا بروتينية (1.20 ميكروجرام / ملجم) مع عائد 136 ميكروجرام ومعدل استرداد 65٪، مما يجعلها الأفضل من حيث نقاء المنتج والجودة.

2. طرق التنقية الأخرى:

ترسب كلوريد الليثيوم

مبدأ تنقية mRNA باستخدام LiCl هو أن الليثيوم قادر على تقليل التنافر الكهروستاتيكي بين الجزيئات عند درجة حموضة معينة، مما يتيح ترسيب RNA بكفاءة.يتم بعد ذلك فصل الرواسب بالطرد المركزي، ثم إذابتها للحصول على عينة RNA نقية. إن ترسيب LiCl بسيط وسريع وفعال لـ mRNAs بأحجام مختلفة، ويعطي منتجات عالية النقاء. ومع ذلك، يمكن لأيونات الليثيوم المتبقية أن تمنع mRNA. يوصى باستخدام ترسيب LiCl للمحاليل التي تحتوي على 400 ميكروجرام/مل على الأقل من RNA لضمان كفاءة التنقية. تنتج هذه الطريقة محصولًا مرتفعًا (210 ميكروجرام)، لكن سلامة المنتج لا تتجاوز 70.2%، مما يقلل بشكل كبير من جودة المنتج. وهي غير مناسبة للإنتاج على نطاق واسع.

طريقة الخرز المغناطيسي:

الخرز المغناطيسي عبارة عن جزيئات صغيرة تتحرك في اتجاه معين تحت مجال مغناطيسي، وتتكون عادةً من قلب من أكسيد الحديد وطلاء خارجي. تعد تنقية الخرز المغناطيسي تقنية شائعة في علم الأحياء الجزيئي لإثراء جزيئات mRNA من الخلائط بسرعة وكفاءة. تحتوي الخرز المغناطيسي الوظيفية المختلفة على مجموعات وظيفية سطحية مختلفة (على سبيل المثال، هيدروكسيل، كربوكسيل، أوليجو (dT)، ستريبتافيدين) لتنقية الجزيئات الحيوية المختلفة.

يمكن للخرز المغناطيسي المكربوكسيل تنقية الأحماض النووية بكفاءة، حيث ترتبط جزيئات mRNA من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية في ظل الظروف الحمضية. تسمح الظروف المعدلة بالارتباط الانتقائي وإطلاق mRNA. ترتبط mRNAs الأطول مع مجموعات الفوسفات المشحونة سلبًا المعرضة بشكل أكبر بالخرز بسهولة أكبر. بالنسبة لـ mRNAs الأقصر، قد تكون هناك حاجة إلى أحجام خرز أكبر. تستخدم الخرز المغناطيسي المقترن بـ Oligo(dT)، على غرار الكروماتوغرافيا التقاربية، ارتباطًا محددًا بين ذيل poly(A) من mRNA وOligo(dT) للخرز.

الترشيح الفائق

تؤدي هذه الطريقة إلى أدنى مستوى لسلامة saRNA، أي أقل بنحو 8% من كروماتوغرافيا التقارب، مع أعلى نسبة بقايا بروتينية (4.58 ميكروجرام/ملجم).

كروماتوغرافيا السليلوز

تحقق هذه الطريقة محتوى منخفضًا من dsRNA (0.009 ميكروجرام/ملجم) ومعدل تغطية مرتفع (96.4%). ومع ذلك، تكون بقايا البروتين أعلى قليلاً (5.30 ميكروجرام/ملجم)، مع معدل استرداد يبلغ 57% فقط وعائد يبلغ 120 ميكروجرام، وكلاهما أقل بكثير من تلك التي تم تحقيقها باستخدام كروماتوغرافيا التقارب (بنحو 10% و16 ميكروجرام على التوالي).

عملية التنقية

مكونات العازل الكروماتوغرافي - إضافة عوامل الاختزال

إن إضافة عوامل الاختزال إلى المحلول المنظم الكروماتوغرافي أثناء التنقية يمكن أن يحسن بشكل كبير من سلامة المنتج ومعدل الاسترداد وكفاءة التغطية، مع تقليل مستويات dsRNA الناتج الثانوي وبقايا البروتين مقارنة بعدم إضافة عوامل الاختزال.

1. بدون عوامل الاختزال:

- العائد: 136 ميكروجرام

- معدل الشفاء: 65%

- النزاهة: 80.3%

- dsRNA: 0.01 ميكروجرام/ملجم

- كفاءة التغطية: 96.4%

- بقايا البروتين: 1.20 ميكروجرام/ملجم

- نقاء المنتج وجودته جيدة.

2. مع عوامل الاختزال (TCPE، DTT، β-mercaptoethanol):

- زيادة العائد بمقدار 10-40 ميكروجرام

- يزيد معدل الاسترداد بنسبة 5-18٪

- تتحسن النزاهة بنسبة 1-5% تقريبًا

- كفاءة التغطية: 96.4%

- dsRNA: يصل إلى 0.005 ميكروجرام/ملجم

- بقايا البروتين: تصل إلى 0.20 ميكروجرام/ملجم

- تحسن كبير في نقاء وجودة المنتج.

مكونات العازل الكروماتوغرافي - أنواع عوامل الاختزال

يمكن أن تعمل أنواع مختلفة من عوامل الاختزال المضافة إلى المحلول المنظم الكروماتوغرافي على تحسين سلامة المنتج ومعدل الاسترداد وكفاءة التغطية، مع تقليل بقايا الحمض النووي الريبوزي ثنائي الفينيل وبقايا البروتين. وقد وجد أن TCPE هو عامل الاختزال الأكثر فعالية.

- مع TCPE:

- العائد: 175 ميكروجرام

- معدل الشفاء: 83%

- النزاهة: 85.2%

- dsRNA: 0.005 ميكروجرام/ملجم

- كفاءة التغطية: 96.4%

- بقايا البروتين: 0.20 ميكروجرام/ملجم

- جودة ونقاء المنتج ممتازة.

مكونات العازل الكروماتوغرافي - تركيز عوامل الاختزال

إن إضافة عوامل الاختزال بتركيز 5-15 مليمول في المحلول العازل الكروماتوغرافي يمكن أن يحسن بشكل كبير من سلامة المنتج ومعدل الاسترداد وكفاءة التغطية، مع تقليل بقايا dsRNA والبروتين. التركيز الأمثل هو 10 مليمول.

1. إضافة 5-15mM TCPE:

- العائد: 160-178 ميكروجرام

- معدل الاسترداد: 76-85%

- النزاهة: حوالي 85٪

- dsRNA: 0.002-0.005 ميكروجرام/ملجم

- كفاءة التغطية: 96.4%

- بقايا البروتين: 0.20-0.52 ميكروجرام/ملجم

- جودة ونقاء المنتج جيدة.

2. مع 10mM TCPE:

- العائد: 178 ميكروجرام

- معدل الشفاء: 85%

- النزاهة: 85.4%

- dsRNA: 0.002 ميكروجرام/ملجم

- كفاءة التغطية: 96.4%

- بقايا البروتين: 0.20 ميكروجرام/ملجم

- نقاء وجودة المنتج الأمثل.

نسبة الغسيل

إن التحكم في نسبة العازل الكروماتوغرافي إلى ماء الحقن في عملية الغسيل (10-25): (75-90) يمكن أن يحسن بشكل كبير من سلامة المنتج ومعدل الاسترداد وكفاءة التغطية، مع تقليل بقايا dsRNA والبروتين. النسبة المثلى هي 15:85.

1. النسبة (10-25):(75-90):

- العائد: 150-179 ميكروجرام

- معدل الاسترداد: 71-85%

- النزاهة: 84-90%

- dsRNA: 0.002-0.006 ميكروجرام/ملجم

- كفاءة التغطية: 96.4%

- بقايا البروتين: حوالي 0.20 ميكروجرام/ملجم

- جودة ونقاء المنتج جيدة.

2. مع نسبة 15:85:

- العائد: 179 ميكروجرام

- معدل الشفاء: 85%

- النزاهة: 90.0%

- dsRNA: 0.002 ميكروجرام/ملجم

- كفاءة التغطية: 96.4%

- بقايا البروتين: 0.20 ميكروجرام/ملجم

- نقاء وجودة المنتج الأمثل.

طرق التنقية المشتركة

إن استخدام مجموعة من طرق التنقية المختلفة يمكن أن يقلل بشكل أكبر من مستويات dsRNA وبقايا البروتين في المنتج، مما يعزز الجودة الإجمالية. الترتيب المفضل لطرق التنقية هو: كروماتوغرافيا التقارب > الترشيح الفائق + كروماتوغرافيا التقارب > كروماتوغرافيا التقارب + كروماتوغرافيا السليلوز > كروماتوغرافيا السليلوز + الترشيح الفائق. توفر كروماتوغرافيا التقارب وحدها أفضل النتائج.

1. كروماتوغرافيا التقارب وحدها:

- العائد: 179 ميكروجرام

- معدل الشفاء: 85%

- النزاهة: 90.0%

- dsRNA: 0.002 ميكروجرام/ملجم

- كفاءة التغطية: 96.4%

- بقايا البروتين: 0.20 ميكروجرام/ملجم

- أعلى نقاء وجودة للمنتج.

2. الترشيح الفائق + الكروماتوغرافيا التقاربية:

- العائد: 170 ميكروجرام (9 ميكروجرام أقل من كروماتوغرافيا التقارب وحدها)

- معدل الاسترداد: 81% (4% أقل من كروماتوغرافيا التقارب وحدها)

- النزاهة: 88.5%

- dsRNA: 0.0015 ميكروجرام/ملجم

- بقايا البروتين: 0.18 ميكروجرام/ملجم

- انخفاض طفيف في بقايا dsRNA والبروتين مقارنة بالكروماتوغرافيا التقاربية وحدها، ولكن انخفاض كبير في العائد ومعدل الاسترداد. هذه الطريقة أكثر تعقيدًا، مما يؤدي إلى مضاعفة وقت التنقية وزيادة التكاليف.

3. كروماتوغرافيا التقارب + كروماتوغرافيا السليلوز / كروماتوغرافيا السليلوز + الترشيح الفائق:

- dsRNA: 0.005 ميكروجرام/ملجم أقل من الطرق الفردية

- العائد: 60-100 ميكروجرام أقل

- معدل الاسترداد: أقل بنسبة 30-40%

- تؤدي الخطوات المتزايدة إلى ارتفاع تكاليف العمالة والمواد.

الإنتاج على نطاق واسع

في الإنتاج واسع النطاق، باستخدام كروماتوغرافيا التقارب، أو كروماتوغرافيا التقارب مع كروماتوغرافيا السليلوز، أو الترشيح الفائق مع كروماتوغرافيا التقارب، يزيد إنتاج mRNA المضخم ذاتيًا بشكل كبير إلى 140-185 ميكروجرام، مع معدل استرداد 67-88٪. سلامة المنتج هي 93-94٪، ويتم التحكم في محتوى dsRNA في حدود 0.0018-0.0020 ميكروجرام / ملجم، وتصل كفاءة التغطية إلى 96.1-96.4٪، ويتم الاحتفاظ ببقايا البروتين في حدود 0.04-0.05 ميكروجرام / ملجم. وهذا يوضح قابلية التوسع والكفاءة الجيدة للإنتاج على نطاق واسع.

مرجع:

[1] ترسيب كلوريد الليثيوم لتنقية الحمض النووي الريبي، تم الاسترجاع في 8 يناير 2024، من https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/references/ambion-techsupport/rna-isolation/general-articles/the-use-of-licl-precipitation-for-rna-purification.html.

[2] ورقة معلومات المنتج لمحلول ترسيب كلوريد الليثيوم، تم استرجاعها في 8 يناير 2024، من https://www.thermofisher.cn/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFSAssets%2FLSG%2Fmanuals%2F4386633_LithiumChloridePrecipSol_PI.pdf.

[3] منتج BeyoMag™ RNA Clean Magnetic Beads، تم استرجاعه في 8 يناير 2024، من https://www.beyotime.com/product/R0081-1ml.htm.

[4] منتج VAHTS RNA Clean Beads، تم استرجاعه في 8 يناير 2024، من https://www.vazyme.com/product/215.html.

[5] Dynabeads™-Based Solid-Phase In Vitro Transcription and RNA Purification، تم الاسترجاع في 8 يناير 2024، من https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/cn/zh/65020D.

[6] أداء وبيانات RNA Clean XP، تم استرجاعها في 8 يناير 2024، من https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/rna-and-cdna/performance.

[7] أخبار من ThermoFisher Scientific، تم استرجاعها في 8 يناير 2024، من https://bydrug.pharmcube.com/news/detail/39287a37147e22e2d978f7dd9228df58.

[8] طرق الإنتاج الصناعي وفصل وتنقية السائل الخام المضخم ذاتيًا لـ mRNA وتطبيقاته [P]. براءة اختراع: CN118048418A. 2024.05.17.

معلومات الطلب

قام Yeasen بتطوير بوليميراز CleaScrip™ T7 RNA الجديد وهو إنزيم من الدرجة الأولى لتخليق mRNA، لذلك لم تعد معالجة السليلوز ضرورية لإزالة dsRNA، مما يوفر الوقت وتكاليف العمالة. محتوى dsRNA في mRNAs المنتجة بواسطة بوليميراز CleaScript™ T7 RNA أقل من المحتوى في mRNAs المنتجة بواسطة بوليميراز Wild Type T7 RNA، سواء قبل أو بعد خطوة إزالة dsRNA باستخدام معالجة السليلوز. تحقق من المزيد من التفاصيل من الروابط التالية: