مجموعة تصنيع الحمض النووي الريبوزي T7 عالي الغلة يعمل على تحسين نظام تفاعل النسخ. يمكن للمجموعة تصنيع الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة بكفاءة باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي T7، والحمض النووي الخطي مزدوج السلسلة مع تسلسل المروج T7 كقالب، وNTPs كركيزة للتحكم في تسلسل الحمض النووي أسفل المروج. أثناء النسخ، يمكن إضافة نيوكليوتيدات معدلة إلى الركيزة لإعداد البيوتين أو الحمض النووي الريبي المصبوغ.

1. مقدمة لمجموعة تصنيع الحمض النووي الريبي عالي الغلة T7
2. مبادئ في المختبر النسخ
3. مزايا مجموعة Yeasen T7 High Yield RNA Synthesis Kit
4. أداء المنتج
5. كيفية استخدام هذه المجموعة
6. الأسئلة الشائعة
7. معلومات الطلب

1. مقدمة لمجموعة تصنيع الحمض النووي الريبي عالي الغلة T7

يمكن لمجموعة تصنيع الحمض النووي الريبي عالي الغلة T7 تصنيع كل من النسخ الطويلة والقصيرة، ويمكن إنتاج الحمض النووي الريبي 100-200 ميكروجرام مع إدخال 1 ميكروجرام من قالب الحمض النووي. يمكن استخدام الحمض النووي الريبي المصنّع في تطبيقات لاحقة مختلفة، مثل البحث في بنية الحمض النووي الريبي ووظيفته، وحماية RNase، وتهجين المسبار، وتداخل الحمض النووي الريبي، والحقن المجهري، في المختبر ترجمة.

2. مبادئ في المختبر النسخ

الشكل 1. في المختبر عملية النسخ

3. مزايا مجموعة Yeasen T7 High Yield RNA Synthesis Kit

إنتاجية عالية للغاية - تصل إلى 200 ميكروجرام في ساعتين
متعدد الاستخدامات - مناسب لنسخ الحمض النووي الريبي 20nt-10000nt
استخدامات متعددة - توليد الحمض النووي الريبوزي غير المسمى أو المسمى أو المغطى

4. أداء المنتج

الشكل 2. مقارنة عائد IVT

ملحوظة: جميع كواشف التفاعل مأخوذة من مجموعة تركيب الحمض النووي الريبوزي T7 (Yeasen#10623 أو شركة B*). تظهر أعلاه نتائج تفاعل IVT لشركة Yeasen وشركة B*.

الشكل 3. جودة المنتجات النسخية لأطوال مختلفة

الشكل 4. مستوى التعبير عن mRNA المنقول في خلايا HEK-293

ملاحظة: تم تغطية mRNA بإنزيم Vaccinia Capping Enzyme (Yeasen#10614/10615)

5. كيفية استخدام هذه المجموعة

5.1 كواشف التذويب

قم بطرد خليط بوليميراز الحمض النووي الريبوزي T7 لفترة وجيزة ثم ضعه على الثلج. قم بإذابة 10 × من محلول النسخ والريبونوكليوتيدات (ATP، CTP، GTP، UTP)، ثم امزجه وقم بطرده إلى أسفل الأنبوب، ثم ضع 10 × من محلول النسخ في درجة حرارة الغرفة وضع أربعة أنواع من الريبونوكليوتيدات على الثلج.

5.2 قم بإعداد نظام تفاعل النسخ وفقًا للجدول التالي

الجدول 1.طريقة تحضير نظام التفاعل النسخي

ملحوظة:
أ) يتم تحضير التفاعل في درجة حرارة الغرفة. نظرًا لأن محلول النسخ 10x يحتوي على مادة سبيرميدين، فإن تركيز مادة سبيرميدين المرتفع جدًا في درجات الحرارة المنخفضة سيؤدي إلى ترسب قالب الحمض النووي.
ب) يمكن استخدام نسخة قصيرة (<100 nt)، قالب 2 ميكروغرام، وزيادة وقت النسخ إلى 4-8 ساعات.
ج) بالنسبة للنسخ الطويلة (>1000 nt)، يوصى باستخدام قوالب البلازميد الخطية للنسخ.
د) قم بإجراء التفاعل في جهاز PCR مع فتح الغطاء الساخن لمنع تبخر محلول التفاعل لفترة طويلة.
هـ) قد يحتوي ناتج التفاعل على راسب أبيض. وهو عبارة عن بيروفوسفات المغنيسيوم المتكون من بيروفوسفات حرة وأيونات المغنيسيوم أثناء التفاعل، ولن يؤثر ذلك على التجارب اللاحقة. يمكنك إضافة EDTA لإزالته. إذا كنت قلقًا بشأن تأثير إضافة EDTA على التجارب اللاحقة، فيمكن أيضًا استعادة السائل العلوي عن طريق الطرد المركزي.
و) يجب أن تكون الكواشف والحاويات خالية من التلوث بـ RNase.

5.3 احضنها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين

امزج محلول التفاعل أعلاه، ثم ضعه في جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة في قاع الأنبوب، واحتضنه عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. إذا كان طول النسخة أقل من 100 nt، فقم بزيادة وقت التفاعل إلى 4-8 ساعات.

5.4 علاج DNase I (اختياري)

بعد اكتمال التفاعل، أضف 2 ميكرولتر من DNase I (خالي من RNase) إلى كل أنبوب وقم بحضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة قالب DNA.

6. الأسئلة الشائعة

6.1 العائد من تفاعل IVT منخفض

ترتبط جودة القالب ارتباطًا وثيقًا بالعائد. إذا كان عائد المجموعة التجريبية أقل بشكل ملحوظ من عائد مجموعة التحكم الإيجابية، فقد تكون الأسباب المحتملة هي:
① تحتوي القوالب على مكونات تعمل على تثبيط تفاعل IVT.
② هناك خطأ ما في القوالب.

6.2 الاقتراحات

① أعد تنقية القالب.
② التأكد من تركيز و سلامة القوالب.
③ تمديد وقت رد الفعل.
④ زيادة مدخلات القالب.
⑤جرب بوليميرات الحمض النووي الريبوزي الأخرى والمحفزات المقابلة.

6.3 إن إنتاج النصوص القصيرة منخفض

إذا كانت النسخ المستهدفة أقل من 100 nt، قم بتمديد وقت التفاعل إلى 4-8 ساعات أو قم بزيادة إدخال القوالب إلى 2 ميكروجرام في نظام تفاعل 20 ميكرولتر.

6.4 هناك نصوص أطول غير متوقعة

إذا أظهرت نتيجة التحليل الكهربائي للهلام وجود نصوص أطول غير متوقعة، فقد تكون الأسباب المحتملة هي:
① قد لا تكون قوالب البلازميد خطية بالكامل.
②تحتوي القوالب على نهايات متماسكة مع نتوءات طولها 3 أقدام.
③تحتوي النسخ على بنية ثانوية ليست مشوهة تمامًا.

6.5 اقتراحات

①تحقق مما إذا كانت قوالب البلازميد خطية بالكامل. إذا لزم الأمر، قم بإجراء خطية البلازميد مرة أخرى.
②اختر إنزيمات تقييد مناسبة لخطية قوالب البلازميد وتجنب إنتاج نهايات متماسكة ذات نتوءات 3'. من الممكن استخدام شظية كلينو أو بوليميراز الحمض النووي T4 لإنتاج نهاية غير حادة إذا لزم الأمر.
③استخدم الجل المشوه للكشف عن النسخ.

6.6 هناك نصوص أقصر غير متوقعة

إذا أظهرت نتيجة التحليل الكهربائي للهلام وجود نسخ أقصر غير متوقعة، فقد تكون الأسباب المحتملة هي:
①يوجد تسلسل مشابه لتسلسل إنهاء بوليميراز RNA T7 في القوالب.
②محتوى GC للقالب مرتفع.

6.7 الاقتراحات

①خفض درجة حرارة التفاعل (مثل 30 درجة مئوية) ولكن لاحظ أن خفض درجة حرارة التفاعل في بعض الأحيان قد يؤدي إلى تقليل العائدات.
②جرب بوليميرات RNA أخرى لتحفيز تفاعل IVT.
③إذا كان محتوى GC في القوالب مرتفعًا، اضبط درجة حرارة تفاعل IVT على 42 درجة مئوية أو أضف SSB إلى نظام تفاعل IVT لزيادة العائدات وطول النسخ.

6.8 يحدث تلطيخ للنسخ أثناء التحليل الكهربائي للهلام

إذا حدث تشويه للنصوص أثناء التحليل الكهربائي للهلام، فقد تكون الأسباب المحتملة هي:
①هناك تلوث بـRNase أثناء التشغيل التجريبي.
②قوالب الحمض النووي ملوثة بـ RNases.

6.9 اقتراحات

①تأكد من أن جميع الكواشف مصنعة باستخدام ماء خالٍ من RNase. استخدم أطراف ماصة خالية من RNase وأنابيب Eppendorf وارتدِ قفازات وأقنعة لاتكس يمكن التخلص منها أثناء التشغيل التجريبي.
②إعادة تنقية قوالب الحمض النووي.

7. معلومات الطلب

المنتجات التالية هي منتجات تمثيلية تقدمها شركة Yeasen. تتوفر أحجام إضافية. منتجاتنا مُحسَّنة للغاية للعمل بشكل متناغم، للمساعدة في ضمان الأداء المتفوق والقدرة على التكرار.
يمكننا أيضًا تقديم خدمات مخصصة. إذا كنت مهتمًا بمنتج غير معروض، فاتصل بنا وسنعمل معك لتلبية احتياجاتك.

الجدول 2.معلومات المنتج

فيما يتعلق بالقراءة:

كواشف من الدرجة GMP لتخليق mRNA في المختبر

مواد خام لتخليق mRNA في المختبر من Yeasen Biotechnology GMP