الشكل 1: عملية نسخ الحمض النووي الريبي في المختبر

مزايا المنتج

غلة عالية: يمكن أن تنتج ما يصل إلى 200 ميكروجرام في ساعتين من خلال تفاعل النسخ

تنوع أفضل: مناسب لنسخ الحمض النووي الريبوزي 20nt-10000nt

أداء ممتاز: تقليل المنتجات الثانوية للنسخ أثناء عملية IVT بشكل فعال

تطبيقات متعددة: يمكن استخدامه في تخليق الحمض النووي الريبي العادي والمُسمى والمُعدل

خصائص المنتج

الشكل 2: إنتاج النسخ ذات الأطوال المختلفة

الشكل 3: جودة النصوص المكتوبة بأطوال مختلفة

الشكل 4: التعبير عن منقولة الرنا المرسال في هيك-293 خلايا

ملاحظة: تم تغطية mRNA باستخدام إنزيم Vaccinia Capping Enzyme (Yeasen#10614/10615).

الأساليب التجريبية

مواد إذابة الجليد

قم بطرد خليط بوليميراز RNA T7 لفترة وجيزة ثم ضعه هو - هي على الجليد. قم بإذابة 10 × منظِّم النسخ والريبونوكليوتيدس (ATP، CTP، GTP، UTP)، امزجها ثم ضعها في جهاز الطرد المركزي في قاع الأنبوب، ضع 10 × Transcription Buffer في درجة حرارة الغرفة، ثم ضع 4 أنواع من الريبونوكليوتيدات على الثلج.

ب.تفاعل النسخ التجميعي في درجة حرارة الغرفة

قم بإعداد نظام التفاعل وفقًا للنظام التالي:

عناصر	الحجم (ميكرولتر)	التركيز النهائي
RNase خالية من H2ا	حتى 20	-
10×مخزن النسخ	2	1×
CTP / GTP / ATP / UTP (100 مليمول لكل منهما)	2 لكل منهما	10 مليمول لكل منهما
قالب الحمض النووي	1 ميكروجرام	-
مزيج بوليميراز الحمض النووي الريبوزي T7	2	-

ملحوظات:

1. يتم تكوين التفاعل عند درجة حرارة الغرفة. نظرًا لأن 10× Transcription Buffer يحتوي على سبيرميدين، فإن التركيز العالي من سبيرميدين قد يتسبب في ترسب قالب الحمض النووي عند درجة حرارة منخفضة.
   بالنسبة للنصوص القصيرة (<100 nt)، يمكن استخدام قالب 2 ميكروغرام، ويمتد وقت النسخ إلى 4-8 ساعات.
   3. بالنسبة للنسخ الطويلة (>1000 nt)، يوصى باستخدام البلازميدات الخطية كقوالب للنسخ.
   4. قم بإجراء التفاعل في جهاز PCR مع فتح الغطاء الساخن لمنع التبخر.
   5. قد يكون لمنتج التفاعل راسب أبيض. الراسب هو بيروفوسفات المغنيسيوم الناتج عن أيونات البايروفوسفات والمغنيسيوم الحرة في محلول التفاعل والتي لا تؤثر على التجارب اللاحقة. إذا كنت ترغب في إزالتها، يمكنك إضافة بعض EDTA. إذا كان إضافة EDTA يؤثر على التجارب اللاحقة، يمكن أيضًا استعادة السائل العلوي عن طريق الطرد المركزي.
   6. احفظ الكواشف والحاويات خالية من التلوث بـ RNase.

ج. الحضن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين

قم بخلط مكونات المحلول، ثم قم بطرده مركزيًا لفترة وجيزة إلى أسفل الأنبوب، ثم قم بحضنه عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. إذا كان طول النسخة أقل من 100 nt، فقم بتمديد وقت التفاعل إلى 4-8 ساعات.

علاج D.DNase I (اختياري)

بعد اكتمال التفاعل، أضف 2 ميكرولتر من DNase I (خالي من RNase) إلى كل أنبوب وقم بحضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة قالب DNA.

الأسئلة الشائعة

1. انخفاض إنتاج النسخ

ترتبط جودة القالب ارتباطًا وثيقًا بالعائد. العائد في المجموعة التجريبية أقل بكثير من العائد في المجموعة الضابطة. الأسباب المحتملة هي:

• يحتوي القالب التجريبي على مكونات مثبطة؛
• ربما يكون القالب به خطأ ما.

الاقتراحات: ① إعادة تنقية القالب؛ ② تحديد كمية القالب وسلامته؛ ③ تمديد وقت التفاعل؛ ④ زيادة كمية إدخال القالب؛ ⑤ استخدام عوامل تحفيز أخرى و بوليميرازات الحمض النووي الريبي الأخرى.

2. انخفاض إنتاج النصوص القصيرة

يمكن لشظايا القالب القصيرة أن تمنع التفاعل. عندما يكون ناتج النسخ أقل من 100 nt، إذا كنت ترغب في زيادة العائد، فقم بتمديد وقت التفاعل إلى 4-8 ساعات أو زيادة كمية القالب إلى 2 ميكروجرام.

3. طول نسخ الحمض النووي الريبي هو أكبر من المتوقع

إذا أظهرت نتيجة التحليل الكهربائي أن شريط المنتج أكبر من الحجم المتوقع، فقد تكون الأسباب المحتملة هي: ①قد لا يكون قالب البلازميد خطيًا تمامًا؛ ②الطرف 3' للشريط الحسي له بنية بارزة؛ ③يحتوي الحمض النووي الريبي على بنية ثانوية ليست مشوهة تمامًا.

الاقتراحات: ①تحقق مما إذا كان القالب خطيًا تمامًا، وإذا لزم الأمر، قم بإجراء خطية إضافية؛ ②حدد إنزيم تقييد مناسب لتجنب تجاوزات 3'، أو استخدم بوليميراز DNA Klenow Fragment /T4 لإكمال النسخ قبل المتابعة؛ ③استخدم الجل المُحَلَّل للكشف عن منتجات الحمض النووي الريبي.

4. طول نسخ الحمض النووي الريبي هو الأصغر من المتوقع

إذا أظهر التحليل الكهربائي أن شريط المنتج أصغر من الحجم المتوقع، فإن الأسباب المحتملة هي: هي: ①يحتوي القالب على تسلسل إنهاء مشابه لمنتهي بوليميراز RNA T7؛ ②محتوى GC لـ القالب مرتفع جدًا.

الاقتراحات: ① خفض درجة حرارة التفاعل (على سبيل المثال، 30 درجة مئوية). في بعض الأحيان، قد يساهم خفض درجة الحرارة في إطالة مدة النسخ، ولكن قد يؤدي إلى: تقليل العائد. حاول طرقًا أخرى بوليميرازات الحمض النووي الريبي للنسخ؛ ②إذا كان محتوى GC القالب مرتفعًا، فقم بإجراء التفاعل عند 42 درجة مئوية، أو أضف SSB لزيادة العائد وطول النسخ.

5. الذيل الكهربائي للمنتجات النسخية

قد يكون سبب الذيل أثناء التحليل الكهربائي هو: ① تلوث RNase أثناء التشغيل التجريبي؛ ②قالب الحمض النووي ملوث بـ RNases.

الاقتراحات: ①استخدم أطراف الماصة الخالية من RNase وأنابيب EP، وارتدِ قفازات وأقنعة لاتكس يمكن التخلص منها، ويجب تحضير جميع الكواشف باستخدام بيروكسيد الهيدروجين الخالي من RNase.₂O. ②إعادة تنقية قالب الحمض النووي.

معلومات الطلب

اسم المنتج	رقم الكتالوج	سالمواصفات
مجموعة تصنيع الحمض النووي الريبوزي T7 عالي الغلة	10623ES	50/100/500 ت
بوليميراز T7 RNA بدرجة GMP (250 وحدة/ميكرولتر)	10625ES	10 وحدة دولية/100 وحدة دولية/2500 وحدة دولية/25 وحدة دولية
بيروفوسفاتاز، غير عضوي بدرجة GMP (1 وحدة/ميكرولتر)	10620ES	10 وحدة/100 وحدة/1000 وحدة
مثبط RNase الفأري بدرجة GMP (40 وحدة / ميكرولتر)	10621ES	10 وحدة دراسية/20 وحدة دراسية/100 وحدة دراسية/1 وحدة دراسية
إنزيم تغطية mRNA Vaccinia بدرجة GMP	10614ES	2KU/10KU/100KU
كاب mRNA 2'-O-Methyltransferase بدرجة GMP	10612ES	10 وحدة/50 وحدة/250 وحدة
ديوكسي ريبونوكلياز 1 (DNase I) درجة GMP	10611ES	500/2000/10000 وحدة
مجموعة عزل mRNA من Hieff NGS®	12603ES	24/96 ت