1. مبادئ ويسترن بلوت
لطخة ويسترن (WB)، أو لطخة البروتين المناعية، هي تقنية كلاسيكية للكشف عن بروتينات محددة بناءً على تفاعلات المستضد والجسم المضاد، وتُستخدم على نطاق واسع في علم الأحياء الجزيئي وعلم المناعة والمجالات ذات الصلة. تشمل خطواتها الأساسية ما يلي:
- فصل البروتين:
- تقوم تقنية SDS-PAGE بفصل البروتينات المشوهة حسب الوزن الجزيئي.
- يغطي SDS البروتينات بشحنة سلبية موحدة، مما يزيل التأثيرات البنيوية.
- نقل الغشاء:
- يتم نقل البروتينات من الهلام إلى غشاء (على سبيل المثال، PVDF أو نتروسليلوز).
- الكشف عن الأجسام المضادة:
- ترتبط الأجسام المضادة الأولية بشكل خاص بالبروتين المستهدف، تليها الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بالإنزيم (على سبيل المثال، HRP) التي تولد إشارة يمكن اكتشافها، مثل الكيمياء الضوئية.
II. سير عمل ويسترن بلوت القياسي
| خطوة | الإجراءات الرئيسية | الكواشف الموصى بها ( |
| 1. إعداد العينة | استخراج البروتينات باستخدام محلول تحلل RIPA؛ إضافة PMSF لتثبيط البروتينات نشاط. | سلسلة RIPA Lisis Buffer، PMSF |
| 2. تحديد كمية البروتين | استخدم طريقة BCA (رقم القطة 20200ES) للقياس الكمي؛ قم بمطابقة محلول التخفيف القياسي مع محلول العينة. | مجموعات قياس كمية BCA (رقم القطة 20200ES/20201ES) |
| 3. الرحلان الكهربائي SDS-PAGE | استخدم الجل الجاهز، وقم بتشغيله على طاقة 150 فولت حتى يصل الصبغ إلى قاع الجل. | المواد الهلامية المصبوبة مسبقًا، عازل تحميل SDS-PAGE |
| 4. نقل الغشاء والانسداد | تنشيط غشاء PVDF (رقم القطعة 36125ES) عن طريق النقع في الميثانول لمدة دقيقة واحدة؛ نقل عند 300 مللي أمبير لمدة 60 دقيقة في حمام جليدي؛ الحجب في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة ساعة واحدة أو استخدام محلول الحجب السريع (رقم القطعة 36122ES) لمدة 10 دقائق. | ترعازل أنسفير، سلسلة غشاء PVDF |
| 5. حضانة الأجسام المضادة | حضن مع الأجسام المضادة الأولية عند 4 درجات مئوية طوال الليل؛ والأجسام المضادة الثانوية عند درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة؛ وغسلها بـ TBST 3 مرات جيدًا. | مخفف الأجسام المضادة |
| 6.كشف البروتين | تطوير مع ECL (رقم القطعة 36208ES). | سلسلة الكيمياء الضوئية ECL |
الشكل 1: سير عمل ويسترن بلوت
ثالثًا: المشكلات الشائعة والحلول
| مشكلة | الأسباب المحتملة | الحلول |
| خلفية عالية  | حجب غير مكتمل | استخدم محلول حجب جديد وقم بتمديد وقت الحجب. |
| الغسيل غير الكافي | قم بزيادة وتيرة الغسيل ومدته لإزالة الارتباط غير المحدد. | |
| تركيز مفرط من الأجسام المضادة الأولية | قم بتخفيف الجسم المضاد إلى التركيز المناسب. | |
| مشاكل جودة العينة | التحقق من نقاء العينة وجودتها؛ استخدام عينات جديدة. | |
| تجفيف الغشاء | تأكد من بقاء الغشاء رطبًا أثناء خطوات الحضانة؛ وتأكد من ملامسته الكاملة لمحاليل التفاعل. | |
| إشارة ضعيفة أو لا توجد إشارة  | نقل غير مكتمل | التحقق من كفاءة النقل وضبط الوقت حسب الحاجة. |
| غشاء PVDF غير المنشط | انقع PVDF في الميثانول لتنشيطه قبل نقله إلى المحلول العازل. | |
| عدم تطابق الأجسام المضادة الأولية مع الأنواع المستهدفة | تحقق من ورقة البيانات، وقارن بين تسلسلات المستضدات والبروتينات، وأدرج التحكم الإيجابي المستخدم على نطاق واسع (على سبيل المثال، β-actin في الخلايا الثديية). | |
| عدم توافق الأجسام المضادة الأولية والثانوية | تأكد من أن الأجسام المضادة الثانوية تتطابق مع الأنواع المضيفة للجسم المضاد الأولي. | |
| ارتباط غير كاف بالأجسام المضادة | زيادة تركيز الأجسام المضادة وإطالة فترة الحضانة عند 4 درجات مئوية (على سبيل المثال، طوال الليل). | |
| مستويات المستضد المنخفضة | قم بتحميل ما لا يقل عن 20-30 ميكروجرام من البروتين لكل مسار؛ استخدم مثبطات البروتين والتحكم الإيجابي. | |
| تعبير البروتين المستهدف المنخفض | تأكيد التعبير في العينة من خلال الأدبيات/قاعدة البيانات؛ التركيز على العينة أو استخدام عنصر تحكم عالي التعبير. | |
| نطاقات غير محددة/نطاقات متعددة  | خطوط الخلايا المتجاوزة التي تغير ملفات البروتين | استخدم خلايا المرور المنخفض (<15 مرورًا) وقم بتشغيل عناصر تحكم موازية مع مخزونات المرور المبكر. |
| تحلل البروتين | قم بإدراج مثبطات البروتيناز في محلول التحلل؛ قم بالتخزين عند درجة حرارة -80 درجة مئوية، وتجنب التجميد والذوبان، واستخدم عينات طازجة. | |
| التعديلات ما بعد الترجمة | تحقق من الأدبيات الخاصة بالتعديلات التي تؤثر على حجم النطاق (على سبيل المثال، اليوبيكويتين، الجليكوزيل). | |
| متغيرات الوصلات المتعددة | التحقق من المتغيرات المتصلة من خلال الأدبيات أو قواعد البيانات. | |
| ثنائيات البروتين/المتعددات | أضف β-mercaptoethanol أو DTT الطازج إلى عازل تحميل SDS. | |
| التلوث البروتيني الخارجي | التحقق من البروتينات الخارجية؛ وتبديل خطوط الخلايا إذا لزم الأمر. | |
| تحميل عينة زائد | تحسين التحميل (20-30 ميكروجرام) بناءً على التعبير المستهدف عبر اختبار التدرج. | |
| تكوين متعددات | غلي العينات لمدة 10 دقائق لتفكيك المتعددات | |
| تركيز عالي من الأجسام المضادة الأولية | تقليل التركيز و/أو وقت الحضانة لتجنب ظهور أشرطة إضافية. | |
| تركيز عالي من الأجسام المضادة الثانوية | تقليل التركيز وإدراج عنصر تحكم ثانوي فقط لتقليل الارتباط غير المحدد. | |
| الكشف عن البروتينات أو أفراد الأسرة غير المبلغ عنها | مراجعة الأدبيات أو BLAST؛ استخدام خطوط الخلايا/الأنسجة الموصى بها. | |
| إذا تم التحقق من ذلك، فقد تكون اكتشفت بروتينًا جديدًا! | ||
| فرق مبتسمة  | هجرة سريعة، درجة حرارة عالية للمخزن المؤقت، تحميل زائد، مخزن مؤقت منخفض | هجرة بطيئة، تبريد مسبق للمخزن المؤقت، تقليل حمولة البروتين، ضمان تغطية المخزن المؤقت للآبار بشكل كامل. |
| أشرطة العبوس  | مشاكل الجهاز (على سبيل المثال، فقاعات تحت الجل) | قم بضبط الإعداد للتخلص من الفقاعات وضمان بلمرة الجل بشكل متساوي. |
| فرق الذيل  | ضعف ذوبان العينة، التحلل، إعادة استخدام العازل | قم بخلط العينات جيدًا، واستخدم عينات طازجة، وقم بإعداد محلول عازل جديد. |
| أشرطة على شكل دمبل  | جل غير متساوي البلمرة، العينات غير النقية | إعادة صب الهلام للحصول على التوحيد؛ قم بطرد العينات مركزيًا قبل الاستخدام. |
| تلطيخ الفرقة  | تحميل زائد، جودة هلام رديئة | تقليل حجم العينة وتحسين تحضير الهلام. |
| علامات الفقاعات  | الهواء المحبوس أثناء النقل | قم بإزالة الفقاعات عند تجميع شطيرة النقل. |
| بقع سوداء غير متساوية  | محلول حجب غير مذاب، توزيع غير متساوٍ للأجسام المضادة | قم بإذابة المحلول المانع بالكامل، ثم اغسله 3 مرات باستخدام TBST، وحركه أثناء الحضانة. |
| بقع بيضاء  | تركيز الأجسام المضادة العالي يؤدي إلى استنزاف الركيزة | انخفاض تركيزات الأجسام المضادة الأولية/الثانوية. |
Ⅳ.أدوات اختيار المنتج وتحسينه
المنتجات ذات الصلة:
| إجراءات | رقم القطة | اسم المنتج | تحديد |
| إعداد العينة | 20101ES | عازل تحلل RIPA (قوي) | 100 مل |
| 20115ES | محلول تحلل RIPA (متوسط) | 100 مل | |
| 20114ES | عازل تحلل RIPA (ضعيف) | 100 مل | |
| 20118ES | مُنظِّم التحلل لتجارب WB/IP | 100 مل | |
| مجموعة قياس كمية بروتين BCA (مُحسّنة) | 500 طن/2500 طن/5000 طن | ||
| مجموعة قياس كمية بروتين BCA (جاهزة للاستخدام) | 500 طن | ||
| الرحلان الكهربائي SDS-PAGE | علامة بروتينية منتظمة النطاق من جولد باند بلس بثلاثة ألوان (8-180 كيلو دالتون) | 250 ميكرولتر/2×250 ميكرولتر/10×250 ميكرولتر | |
| علامة البروتين عالية النطاق GoldBand™ ثلاثية الألوان (10-245 كيلو دالتون) | 2×250 ميكرولتر/10×250 ميكرولتر | ||
| 20328ES | مجموعة تحضير جل SDS-PAGE | مجموعة واحدة (30~50 جل) / مجموعة واحدة (150~250 جل) | |
| مجموعة تحضير سريعة لجل PAGE | التركيزات: 8%، 10%، 12.5%، 15% | ||
| 36259ES-36280ES | جل البروتين الجاهز | التركيزات: 8%،10%،12%،4-12%،4-20% خيارات بئر التحميل: 10 آبار، 12 بئرًا، 15 بئرًا | |
|
نقل الغشاء والانسداد | غشاء PVDF بسمك 0.45 ميكرومتر (لفافة واحدة، 30 سم × 3 م) | 1 لفة | |
| غشاء PVDF بسمك 0.22 ميكرومتر (لفافة واحدة، 30 سم × 3 م) | 1 لفة | ||
| حضانة الأجسام المضادة | 36206ES | مخفف الأجسام المضادة الأولية والثانوية لـ WB | 100 مل/500 مل |
|
كشف البروتين | كاشف الكشف عن Super ECL | 100 مل/500 مل | |
| مجموعة ركيزة كيميائية مضيئة محسنة ECL | 100 مل/500 مل |
الخامس.كيفية الحصول على الدعم
لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها بشكل شخصي أو تحسين البروتوكول:
- يزور:
Yeasen صفحة منتج ويسترن بلوت - بريد إلكتروني: info@yeasenbio.com
القاعدة الذهبية للنجاح: إجراءات موحدة + كواشف عالية الجودة + التحقق خطوة بخطوة = نتائج WB قابلة للتكرار!