وقد ذكر مركز تقييم الأدوية التابع للإدارة الوطنية للمنتجات الطبية بوضوح في إرشاداته الخاصة بمنتجات العلاج الجيني أنه من الضروري التحكم في كمية بقايا الحمض النووي وحجم الشظايا المتبقية، وأوصى بالتحكم في حجم شظايا الحمض النووي المتبقية أقل من 200 زوج أساسي قدر الإمكان. لذلك، فإن إزالة الأحماض النووية المتبقية في المستحضرات الصيدلانية الحيوية أمر بالغ الأهمية. ومع التعقيد المتزايد لعمليات الإنتاج، فإن إزالة الأحماض النووية المتبقية بشكل فعال في البيئات عالية الملح تواجه العديد من التحديات الجديدة:

أثناء عملية تنقية فيروسات AAV، لتحسين عملية استعادة الفيروس، غالبًا ما يتم استخدام مخازن ذات تركيزات أعلى من الملح (200-500 مليمول). ومع ذلك، تظهر النوكليازات التقليدية انخفاضًا كبيرًا في النشاط مع زيادة تركيز الملح. إذا كان من المقرر تحسين تأثير التنقية عن طريق زيادة كمية الإنزيم ووقت الحضانة، فسيؤدي ذلك إلى زيادة التكاليف بشكل كبير
يوجد الحمض النووي للمضيف عادة في شكل كروماتين ويتم تغليفه بسهولة بواسطة البروتينات، مما يجعل الحمض النووي غير قابل للوصول إليه. في البيئات ذات الملوحة العالية، يمكن للأحماض النووية والبروتينات أن تنفصل بشكل فعال، وبالتالي إزالة الأحماض النووية المتبقية بشكل أفضل
يمكن أن تتجمع ناقلات الفيروسات مثل AAV بسبب التفاعلات الكهروستاتيكية، ومن المرجح أن يحدث هذا التجمع في ظل ظروف القوة الأيونية المنخفضة والحمض النووي المتبقي، مما يؤدي إلى انخفاض الاستقرار والتأثير على العائد. يمكن أن يؤدي زيادة تركيز الملح إلى تقليل تراكم جزيئات فيروس AAV بشكل فعال، مما يحسن معدل استرداد جزيئات فيروس AAV

إن UltraNuclease النشط بالملح (النوكلياز واسع الطيف المتحمل للملح) عبارة عن نوكلياز غير محدد معاد التركيب مشتق من الكائنات الحية الدقيقة البحرية. وبالمقارنة مع UltraNuclease، فإنه يظهر نشاطًا مثاليًا عند تركيز ملح 500 مللي مولار ويمكنه إزالة تلوث الأحماض النووية بكفاءة حتى في البيئات عالية الملح.

سيناريوهات تطبيق المنتج

إزالة الأحماض النووية المتبقية في المواد البيولوجية: أثناء إنتاج المواد البيولوجية، مثل الفيروسات واللقاحات والبروتينات، يمكن إضافة UltraNuclease لتحلل الأحماض النووية المتبقية. لا تؤدي هذه الخطوة إلى زيادة إنتاج الفيروسات فحسب، بل تقلل أيضًا بشكل كبير من محتوى الأحماض النووية المتبقية، وبالتالي ضمان سلامة وفعالية الأدوية.
تقليل اللزوجة: عن طريق تحلل الأحماض النووية، يتم تقليل لزوجة محاليل الخلايا، مما يسهل عمليات الترشيح/الترشيح الفائق أثناء تنقية الجسيمات المشتقة من الخلايا مثل الفيروسات، ونواقل الفيروس الغدي المرتبط بالغدة الدرقية، والأجسام المتضمنة.
تحسين الدقة والاسترداد: في تحليل ELISA، والرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد، وتحليل المناعة الغربية، فإنه يحسن الدقة والاسترداد.
منع تراكم الخلايا: يمكن أن يمنع UltraNuclease بشكل فعال تراكم خلايا الدم المحيطية البشرية أحادية النواة (PBMCs).

اختبار أداء المنتج

تأثير البيئة ذات الملوحة العالية على نشاط الانزيم (Na+)

لتتناسب مع استخدام Salt Active UltraNuclease، قامت Yeasen أيضًا بتطوير مجموعة كشف محددة بشكل مستقل لـ ملح نشط الترا نيوكلياز، والتي يمكنها الكشف بشكل فعال عن بقايا الإنزيم وتقليل المخاطر. تم تطوير وإنتاج مجموعة ELISA Salt Active UltraNuclease وفقًا لإرشادات التحقق من صحة الطريقة التحليلية <9101> من دستور الأدوية الصيني لعام 2020، مع الالتزام الصارم بالمتطلبات الرئيسية للاختبار متعدد المعلمات (النطاق الخطي، والخصوصية، والدقة، والحساسية، والاستقرار المتسارع، وما إلى ذلك).

ولتحقيق هذه الغاية، طورت شركة Yeasen Biotech مجموعة ELISA للكشف عن Salt Active UltraNuclease. وتستخدم المجموعة مبدأ اختبار الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ذي الساندويتش المزدوج للأجسام المضادة (ELISA) للكشف عن الكمية المتبقية من Salt Active UltraNuclease. تُضاف العينات القياسية وعينات الاختبار من Salt Active UltraNuclease إلى اللوحة المغلفة بالإنزيم والمطلية مسبقًا بجسم مضاد لـ Salt Active UltraNuclease (36703-A). ثم يُضاف جسم مضاد للكشف عن النوكلياز الموسوم بالبيوتين المخفف (36703-C)، يليه Streptavidin-HRP (SA-HRP) (36703-D). يشكل هذا جسمًا مضادًا + مستضدًا + جسمًا مضادًا-بيوتين + SA-HRP. بعد غسل اللوحة، يُضاف محلول ركيزة TMB (36703-H) لتطوير اللون. تحت تحفيز إنزيم HRP، يتغير TMB من عديم اللون إلى الأزرق ويتحول أخيرًا إلى اللون الأصفر تحت تأثير محلول الإيقاف (36703-I). تتناسب شدة اللون الأصفر بشكل مباشر مع كمية النوكلياز العالمي عالي التحمل للملح المكتشف في العينة.

العملية التجريبية لكشف بقايا Salt Active UltraNuclease باستخدام مجموعة Salt Active UltraNuclease ELISA.

خصائص مجموعة UltraNuclease وAltraNuclease ELISA ذات النشاط الملحي:

الامتثال التنظيمي: تم التحقق من صحتها بالكامل وفقًا للمتطلبات التنظيمية، وتتوفر تقارير التحقق؛

ضمان الجودة: يتم تطوير جميع المواد الخام للمجموعة بشكل مستقل، مما يضمن جودة يمكن التحكم فيها؛

حساسية عالية: الحد الكمي يصل إلى 23 بيكو جرام/مل؛

دقة عالية: إمكانية تكرار عالية داخل الدفعة وتباين منخفض بين الدفعات؛

خصوصية قوية: لا يوجد تفاعل متبادل مع بروتينات الخلايا المهندسة الأخرى

معايير الأداء

معلمات المنتج	محتوى
وقت التحليل	3.5 ساعة
مبدأ التحليل	اختبار المناعة الأنزيمية في موقعين
تضخيم الإشارة	نظام البيوتين-ستربتافيدين
طول موجة الكشف	450 نانومتر و 630 نانومتر
حساسية	0.024 نانوجرام/مل
مدى الكشف	0.047 نانوغرام/مل~3 نانوغرام/مل
كائن الكشف	ملح نشط الترا نيوكلياز
الأداة المعمول بها	الأجهزة الجزيئية: سلسلة M وسلسلة i
طلب	الكشف عن النوكلياز المتبقي في عمليات تنقية العلاج الخلوي والجينى واللقاحات المعاد تركيبها المرتبطة بالفيروس الغدي

بيانات المنتج:

منحنى معيار مجموعة الكاشف:

الخصوصية

تم تقييم التفاعل المتبادل بين الأجسام المضادة Salt Active UltraNuclease والبروتينات السبعة الموجودة في المجموعة باستخدام هذه المجموعة للكشف عن البروتينات المضافة في العمليات السبع. تم إعداد عنصر تحكم إيجابي (PC-0.047 ng/mL) وعنصر تحكم سلبي (NC-0 ng/mL).

وأظهرت النتائج أن البروتين المضاف في العمليات السبع كان قريبًا من التحكم السلبي (NC-0 ng/mL)، وكان تركيز الكشف أقل من حد القياس الكمي لهذه المجموعة (0.047 ng/mL)، ولم يحدث تفاعل متبادل. لاحظ.

سمعدل الاسترداد:

أضف ثلاثة معايير تركيز (أي، المعيار 1 3 نانوجرام/مل، والمعيار 3 0.75 نانوجرام/مل، والمعيار 5 0.188 نانوجرام/مل) بنسب متساوية إلى العينتين اللتين قدمهما العميل لتجربة استعادة الأشواك. تظهر النتائج أن معدلات استعادة الأشواك تتراوح جميعها بين 80% و120%. معدل استعادة الأشواك % = (القيمة المقاسة للعينة المضاف إليها الأشواك - القيمة المقاسة للعينة غير المضاف إليها الأشواك) / القيمة النظرية (كمية المعيار المضافة) * 100%.

اسم العينة	اختبار تركيز Salt Active UltraNuclease (نانوغرام/مل)	كمية المعيار (نانوغرام/مل)	نتيجة الاختبار (نانوغرام/مل)	معدل استرداد السنبلة (%)
تي اس 1	0.04	3	1.71	114.00%
		0.75	0.347	92.53%
		0.188	0.085	90.43%
تي اس 2	0.08	3	1.772	118.13%
		0.75	0.405	108.00%
		0.188	0.104	110.64%

دقة

1) القدرة على التكرار

تم اختيار ثلاثة منتجات قياسية من Salt Active UltraNuclease بتركيزات عالية ومتوسطة ومنخفضة لتكرار التجارب. في نفس التجربة، تم اختبار عينات من كل تركيز لمدة 10 مرات، وكانت نسبة معامل التباين < 10%.

الفرق في الدفعة
التركيز النظري (نانوغرام/مل)	عدد التكرارات	المتوسط (نانوغرام/مل)	معامل التباين CV (%)
1.5	10	1.444	2.97%
0.188	10	0.196	2.27%
0.047	10	0.051	2.56%

2) الدقة المتوسطة

تم استخدام دفعات مختلفة من الأدوات لإجراء 3 تجارب، وتم إجراء كل تجربة بثلاثة تركيزات عالية ومتوسطة ومنخفضة، وتم تكرار كل تركيز 10 مرات. وتم الحصول على إجمالي 30 بيانات من كل نقطة تركيز، وكانت نسبة معامل التباين لكل تركيز أقل من 15%.

فرق الدفعة
التركيز النظري (نانوغرام/مل)	عدد التجارب	المتوسط (نانوغرام/مل)	معامل التباين CV (%)
1.5	3	1.423	5.70%
0.188	3	0.212	5.59%
0.047	3	0.059	6.82%

معلومات المنتج

اسم المنتج	منتج رقم	مواصفات المنتج
ملح نشط UltraNuclease من الدرجة GMP	20159ES25/50/60/80/90	25 وحدة/50 وحدة/100 وحدة/1 وحدة/5 وحدات
مجموعة ELISA من Salt Active UltraNuclease	36703ES96	96 طن

منتجات أخرى ذات صلة

اسم المنتج	رقم المنتج	مواصفات المنتج
UCF.ME®UltraNuclease GMP-grade (Benzonase)	20157ES25/50/60/80/90	25 وحدة/50 وحدة/100 وحدة/1 وحدة/5 وحدات
طقم ELISA UCF.ME® UltraNuclease	36701ES59	96 طن

مقال سابق المقال التالي

UCF.ME ™ Salt Active Ultranuclease: يقلل بشكل فعال بقايا الحمض النووي المضيف إلى درجة PG في بيئات الملح العالي