Kære venner, føler du dig rådvild, når du står over for forskellige Loading Control og Epitope Tagging Antistoffer under proteinimmunoblotting? Indlæsningskontrol proteiner kodes af husholdningsgener i organismer og udtrykkes stabilt i flere væv. De bruges til at verificere, om immunologiske eksperimenter forløber normalt og som en semi-kvantitativ detektionsstandard for proteinekspression. Så hvordan vælger du korrekt ladekontrolantistoffer? Du kan henvise til følgende punkter.

I. Prøve Artsoprindelse

For prøver fra pattedyrsvæv eller -celler skal du generelt vælge β-actin, α-tubulin, GAPDH, Lamin-B, Histone H3, Na+/K+-ATPase.
For planteafledte prøver skal du generelt vælge planteaktin, Rubisco osv.
For andre prøver med mindre forskning, vælg det passende protein som intern reference ved at konsultere relevant litteratur eller databaser.

II. Målproteinets molekylvægt

Sørg for, at molekylvægten af målproteinet adskiller sig fra belastningskontrollens med mere end 5KDa for at forhindre interferens under detektion. For eksempel, hvis målproteinet er 40KDa, er det ikke egnet at vælge β-actin (42KDa) som en ladningskontrol. Overvej at bruge GAPDH (36KDa) eller β-tubulin (55KDa) som belastningskontrol.

III. Ekspressionssted for det interne referenceprotein

Derfor er valget af læssekontrol protein varierer med proteinekstraktionsstedet. For eksempel, når du ekstraherer cytoplasmatiske og nukleare proteiner separat i stedet for totale proteiner, skal du vælge belastningskontrol proteiner udtrykt på det tilsvarende sted. For eksempel er H3 meget og stabilt udtrykt i cellekernen og teoretisk set ikke udtrykt i cytoplasmaet. Så til cytoplasmatisk proteinekstraktion bør H3 ikke bruges som et internt referenceprotein. Vælg i stedet β-actin, GAPDH, α-Tubulin osv., som udtrykkes i cytoplasmaet som interne referenceproteiner.

Bemærk: Undgå følgende situationer under brug belastning af kontrolantistoffer

Subcellulær lokalisering	Indlæser kontrolprotein	Molekylvægt (KDa)	Noter
Cytoplasma, hel celle	β-aktin	42	Ikke egnet til nukleare ekstrakter. β-actin er en bestanddel af kromatin-omdannelseskomplekser; er muligvis ikke egnet til situationer, hvor der er betydelige aldersforskelle blandt forskningspersoner.
	a-tubulin	55	Ikke egnet til situationer, hvor der er betydelige aldersforskelle blandt forskningspersoner. Udtrykket af tubulin ændrer sig med antimikrobielle og antimitotiske lægemidler, så det er ikke egnet, når man tilføjer kræft- og svampedræbende lægemidler.
	β-Tubulin	55
	GAPDH	36	Cellehypoxi vil få udtrykket af GAPDH til at stige, så det er ikke egnet til undersøgelser relateret til ilt. Faktorer som diabetes kan føre til øget ekspression af GAPDH.
	Vinculin	117	Kan henvises til proteiner med stor molekylvægt.
Mitokondrier	COXIV-serien	15-17	Denne serie af proteiner er hovedsageligt koncentreret ved 15-17KDa. Hvis målproteinets molekylvægt er tæt på, skal du overveje andre belastningskontrolantistoffer.
Mitokondrier	HSP60	60
Nucleus	VDAC1/2	31-37	Denne serie af proteiner er hovedsageligt koncentreret ved 31-37KDa.
	Lamin B1	66	Ikke egnet til embryonale stamceller, ikke egnet som belastningskontrol i apoptoseforsøg.
	PCNA	36	Ikke egnet til ikke-prolifererende celler.
	TBP	33-43	TBP er 37-43KDa hos mennesker og 33-36KDa hos mus og rotter, ikke egnet til apoptoseforsøg.
	ÅÅ1	65-70
	Histone H3	17	De fleste proteiner har en molekylvægt på omkring 17KDa. Hvis målproteinets molekylvægt er tæt på, skal du overveje andre belastningskontrolantistoffer.
Fuldblod, serum, plasma	Transferrin	77	Ekspression påvirkes af visse sygdomstilstande og behandlinger, såsom retinsyre.
Fuldblod, serum, plasma	Albumin	66	Indholdet er ekstremt højt, vær opmærksom på at reducere prøvebelastningen i WB-eksperimenter.

Etiket antistoffer fungerer bedre, når de bruges sammen

I eksperimenter, der studerer proteininteraktioner, såsom pull-down, kan epitopmærker fusioneres til N- eller C-terminalen af målproteinet gennem molekylærbiologiske metoder. Almindeligt anvendte epitopmærker inkluderer His, HA, Myc og GST. Disse epitopmærker påvirker sædvanligvis ikke den biologiske aktivitet og intracellulære lokalisering af målproteinet. Fremkomsten af epitopmærker har givet bekvemmelighed for videnskabelig forskning og industriel produktion.

Epitop Tag	Tag-sekvens	Molekylvægt (KDa)
HA Tag	YPYDVPDYA	1.1
Myc Tag	EQKLISEEDL	1.2
Flag Tag	DYKDDDDK	1
GST tag	-	26
GFP-tag	-	26,9
V5 tag	GKPIPNPLLGLDST	1.4
S-tag	KETAAAKFERQHMDS	1.8
E-tag	GAPVPYPDPLEPR	1.4

Produktinformation

Type	Produktnavn	Molekylvægt (KDa)	Produktnummer
Indlæser kontrolantistof	β-actin, muse-mAb	42	30101ES
	β-actin, kanin pAb	42	30102ES
	GAPDH (klon: 1A6), muse-mAb	36	30201ES
	GAPDH, kanin pAb	36	30202ES
	a-Tubulin, muse-mAb	50-55	30304ES
	β-Tubulin, muse-mAb	50-55	30301ES
	β-Tubulin, kanin pAb	50-55	30302ES

Forrige artikel Næste artikel

Vejledning til valg af belastningskontrol og epitopmærkning af antistoffer

Etiket antistoffer fungerer bedre, når de bruges sammen

Produktinformation

Forespørgsel