1 Virkningsprincippet for geneticomycin

Genetomycin (Geneticin, G418) er et aminoglykosid-antibiotikum, der hæmmer proteinsyntesen ved at blokere peptidkædeforlængelsen ved at binde sig til 70S og 80S ribosomer i prokaryote og eukaryote celler. Denne mekanisme er giftig for dem, herunder bakterier, gær, planter og pattedyrceller. Når cellerne var succesfuldt transficeret og integreret med et neomycinresistensgen (såsom neo-genet), kunne den genkodede aminoglycosid-phosphotransferase (APH (3) II) kovalent modificere G418 for at inaktivere den og derved bibringe resistens til celler dyrket i selektivt medium indeholdende G418.

I molekylærgenetiske test er G418 en af ​​de almindeligt anvendte til stabil transfektion.

2 Anvendelsen af ​​geneomycin

2.1 Screening af stabile transficerede cellelinjer

• G418 blev brugt til at screene for celler indeholdende resistensgener (f.eks. neo-gener) ved at hæmme proteinsyntese. Aminoglycosid-phosphotransferasen kodet af resistensgenet inaktiverer G418, hvilket giver celleresistens til G418. Typisk er screeningsområdet for pattedyrceller 200 – 2000 μg/mL, med den mest almindeligt anvendte arbejdskoncentration på 100 – 700 μg/ml. Hvor planteceller er 10-100 μg/mL, og gærceller er 500-1000 μg/mL, er følgende koncentrationer, der bruges til nogle celletyper, der bruger G418 til reference.

Celle	Anvendelse	Aktiveringskoncentration af geneomycin (μg/mL)	Citerede værker
Mucor arter	a) Dyrket i vækstmedium b) Dyrket på frysetørrede bakterier	a) 10 μg/ml b) 30 μg/ml	Hirth, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 7356-7360 (1982).
Pattedyr	a) Til screening b) For at opretholde vækst	a) 400 -1000 μg/mL b) 200 μg/ml	Canaani og Berg, Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 5166-5170 (1982).
Plante	a) Til screening b) For at opretholde vækst	a) 25-50 μg/mL b) 10 μg/ml	Ursic, et. al., Biochem. Biofys. Res. komm., v. 101:3, 1031-1037 (1981).
Gær	a) Til screening b) For at opretholde vækst	a) 500 μg/ml b) 125-200 μg/mL	Jimenez og Davies, Natur, v. 287, 869-871 (1980).
Bakterie	Til screening	16 μg/ml	Waitz, et. al., Antimikrob. Agenter Chemother., v. 6:5, 579-581 (1974).

2.2 Gen-knockout og genoverførsel

• I gen-knockout kan G418 bruges til at screene celler, der med succes knockout målgenet. Ved genoverførsel letter G418 integrationen af ​​fremmede gener i værtscellers genom.

2.3 Resistensudvælgelse i cellekultur

• Under cellekultur bruges G418 til at screene for celler, der er resistente over for antibiotika, som ofte bærer specifikke resistensgener.

3 Relevante eksperimentelle procedurer for geneomycin

3.1 Fremstilling af G418 stamopløsning (50 mg/ml, aktiv koncentration)

1) Konvertering af aktivitetsenheder

Konverter ved hjælp af formlen: (1000/A0) × A1 = A2, hvor A0 er styrken af ​​G418, som varierer efter batch. Se kvalitetskontrolrapporten for den tilsvarende batch eller etiketten på flasken. A1 er den ønskede aktive koncentration af G418, der skal fremstilles. A2 er den faktiske pulver-til-volumen koncentration, der skal vejes.

For eksempel, hvis batchen af ​​G418 har en styrke på 750 U/mg, og du ønsker at forberede en aktiv koncentration på 50 mg/mL, så er den faktiske pulverkoncentration, der skal tilberedes, 1000/750 × 50 mg/mL = 66,67 mg/mL.

Hvis der tilberedes 10 ml G418-stamopløsning (aktiv koncentration, 50 mg/ml), er 666,7 mg pulver påkrævet.

• Sterilisering og opbevaring

Baseret på den faktiske pulvervægt opnået fra ovenstående konvertering, tilsæt det til 10 ml sterilt deioniseret vand for at opløses fuldstændigt.

Først forvandes et 0,22 μm sprøjtefilter med 5 ml sterilt deioniseret vand, og fjern alt vand. Filtrer derefter ved hjælp af dette filter til at sterilisere og alikvoter i små mængder til engangsbrug (f.eks. 1 mL) og opbevares ved -20°C i 1 års stabilitet.

3.2 Etablering af Kill Curve

1) Dag et: Plad utransformerede celler ved 20-25% celletæthed i passende kulturplader og inkuber natten over ved 37°C, CO₂.

2) Indstil en koncentrationsgradient inden for et passende interval baseret på celletype, og vælg mindst 6 koncentrationer (G418 er mest aktiv mod celler i delingsfasen, så cellerne bør dyrkes i en periode før tilsætning af G418), f.eks.

3) Dag to: Fjern gammelt dyrkningsmedium og erstat med frisklavet medium indeholdende den tilsvarende koncentration af lægemidlet, med tre replikater for hver koncentration.

4) Udskift med frisk lægemiddelholdigt medium hver 3.-4. dag.

5) Udfør levende celletællinger med faste intervaller (f.eks. hver anden dag) for at bestemme den passende koncentration, der forhindrer væksten af ​​utransficerede celler. Vælg den laveste koncentration, der kan dræbe flertallet af celler inden for det ideelle antal dage (normalt 7-10 dage) som arbejdskoncentration for stabil transficeret cellelinjescreening.

3.3 Screening af stabile transficerede celler

• G418 Geneticin (60220ES) leveret af Yisheng Biotech har en effektivitet på ≥720 U/mg, en renhed på ~98% og batchstabilitet, med en pris på næsten en tredjedel af andre virksomheders G418-produkter.
• Screeningsmediet indeholdende lægemidlerne blev udskiftet hver 3.-4. dag.
• Dannelsen af ​​cellekloner (kolonier) blev observeret og vurderet efter 7 dages selektion. Det kan tage en uge eller mere at danne kolonier, afhængigt af værtscelletypen, transfektion og screeningseffektivitet.
• 5-10 resistente kloner blev plukket og overført til 35 mm cellekulturplader og yderligere holdt med lægemiddelholdigt screeningsmedium i 7 dage.
• Efter at have ændret den normale mediumkultur.

4 Produktanbefaling

G418 Geneticin (60220ES) leveret af Yeasen Biotech har en effektivitet på ≥720 U/mg, en renhed på ~98% og batchstabilitet med en pris på næsten en tredjedel af andre virksomheders G418-produkter.

Specifikation	S*	T*	Yeasen	Yeasen fordel
Indhold (HPLC)	/	/	~98 %	Høj renhed
Styrke (U/mg)	≥720 µg/mg	707-721 µg/mg	≥720 µg/mg	Høj effektivitet
Pris ($/5 g)	~1000	~1000	~200	billighed

5 Eksperimentel sag

I E. coli var G69 og G99 to forskellige batcher; koncentrationerne af genomycin var henholdsvis 8 mg/L, 12 mg/L og 16 mg/L, og den effektive minimumskoncentration var 16 mg/L, hvilket fuldstændig hæmmede væksten af ​​diverse bakterier.