Hvad er Aureobasidin A
Aureobasidin A (AbA) er et cyklisk peptidantibiotikum isoleret fra trådsvampen Aureobasidium pullulans nr. R106, som har stærke svampedræbende egenskaber og kan være giftig for gær ved lave koncentrationer (0,1-0,5 μg/mL). Virkningsmekanismen for AbA er gennem inhibering af aktiviteten af inositolphosphorylceramidsyntase (IPC-syntase), et enzym kodet af AUR1-genet i gær, hvilket blokerer syntesen fra ceramid til inositol-phospholipider, hvilket fører til en mangel på sphingolipider, hvilket dræber cellemembranen, og membranen sprænges. Svampearter, der er følsomme over for AbA, omfatter Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans og A. niger.
Figur 1 Strukturformel for AbA, CAS#127785-64-2
Forskning har fundet ud af, at AUR1-genet fra Saccharomyces cerevisiae og AURA-genet fra Aspergillus nidulans er homologe, begge koder for IPC-syntase. Derfor kan mutationer i disse to gener give stærk AbA-resistens over for stammer, såsom det muterede gen AUR1-C. AbA er meget velegnet som lægemiddelselektionsmarkør til screening af positive kloner, og det kræver ikke tilstandsoptimering med en meget lav baggrund. AbA-resistens er også en ideel reporter til enkelt-/dobbelthybridundersøgelser af gær og er kompatibel med gærhybridsystemer, der bærer tilsvarende resistens.
Hvad er Gær Single/Double Hybrid System
Gær-to-hybrid-systemet (Gær to-hybrid-assay) blev skabt af Fields og Song og andre baseret på egenskaberne ved eukaryotisk transkriptionel regulering. Det kan hurtigt og direkte analysere interaktionerne mellem kendte proteiner og er meget brugt i studiet af antigen-antistof-interaktioner, opdagelsen af nye proteiner og nye proteinfunktioner, screening for lægemiddelmål og etablering af genomiske proteinbindingskort. Princippet for gær-to-hybrid er, at den transkriptionelle aktivator af eukaryoter indeholder to forskellige strukturelle domæner: DNA-bindingsdomænet (DNA-bindingsdomæne, DNA-BD) og DNA-transskriptionsaktiveringsdomænet (Activation domain, AD), som uafhængigt kan adskilles uden at påvirke hinandens funktion. BD og AD alene kan ikke aktivere det transkriptionelle respons, kun når de to er rumligt tæt nok, udviser de aktiviteten af en komplet transkriptionel aktivator, hvilket tillader nedstrømsgenet at blive transskriberet. Ved at konstruere fusionsplasmider af de to proteiner under undersøgelse (protein X og protein Y) med henholdsvis BD- og AD-domæner og udtrykke dem i den samme gærcelle, hvis der ikke er nogen interaktion mellem de to proteiner, vil reportergenet ikke blive transskriberet; hvis de to proteiner interagerer, vil BD- og AD-domænerne være rumligt tætte, således at reportergenet transskriberes.
Figur 2 Principdiagram af gær to-hybrid [1]
Gær en-hybrid-teknologi er et værktøj til at studere nukleinsyre-protein-interaktioner, udviklet på basis af gær-to-hybrid, og er meget brugt til at studere ekspressionsreguleringen af gener i eukaryote celler, såsom at identificere om der er en interaktion mellem kendt DNA og kendte proteiner; isolering af nye proteiner, der binder til det mål-cis-regulatoriske element eller andre korte DNA-bindingssteder; nøjagtig lokalisering af de DNA-bindingssteder, der har vist sig at interagere, og analysere DNA-bindingsdomænerne af proteiner. Dets grundlæggende princip er at konstruere det kendte cis-virkende element opstrøms for den mest basale promotor (minimal promotor, Pmin) og forbinde reportergenet nedstrøms for Pmin. cDNA'et, der koder for transkriptionsfaktoren, der skal testes, fusioneres med gær-AD-domæneekspressionsvektoren og indføres i gærceller.Hvis produktet af dette gen kan binde til det cis-virkende element, kan det aktivere Pmin-promotoren, hvilket tillader reportergenet at blive udtrykt.
Figur 3 Principdiagram af gær en-hybrid [2]
Til enkelt-/dobbelthybridundersøgelser af gær tilbyder Yeasen produkt 60231ES Aureobasidin A (AbA), en opløsning af AbA opløst i methanol med en renhed på ≥ 97 % og en koncentration på 1 mg/ml. Yeasen anbefaler en AbA-hæmmende koncentration på 100-1000 ng/mL i enkelt-/dobbelthybridforsøg med gær, og den specifikke arbejdskoncentration afhænger af værtscellernes følsomhed (se følgende tabel, Minimum hæmmende koncentrationer (MIC) af AbA for forskellige gærstammer).
| Bakteriel belastning | MIC (ng/ml) | |
| S. cerevisiae | ATCC9763 (diploid) | 200-400 |
| SH3328 (haploid) | 100 | |
| Sake gær (diploid) | 100-200 | |
| Shochu gær (diploid) | 100 | |
| Ølgær (triploid eller tetraploid) | 100 | |
| Bagegær (diploid) | 200-400 | |
| Schizo.pombe | JY-745 (monoploid) | 100 |
| C.albicans | TIMM-0136 (diploid) | 40 |
| C.tropicalis | TIMM-0324 (diploid) | 80 |
Ansøgningssag
For at studere bindingsstedet for GmWRKY31-protein på promotoren af GmSAGT1-genet, i gær en-hybrid-eksperimentet, blev mål-DNA-sekvensen indsat i pBait-AbAi-vektoren indeholdende uracil-reportergenet Ura3, placeret opstrøms for AUR1-C-genet. Efter gærtransformation med det tilsvarende plasmid blev det suspenderet i 0,9% NaCl-opløsning, og OD600 blev justeret til 0,005. Efterfølgende blev 100 μL af prøven spredt på plader indeholdende 500 ng/mL AbA, vendt og dyrket ved 30 ℃ i 3-5 dage[3].
Figur 3 Interaktion af GmWRKY31-protein med gærstammer indeholdende fragmenter F16, F20, F73, delF16, delF20 eller delF73.
Udgivet artikler med vores reagenser
[1] Shunan Zhang, Yuyi Zhang, Kangning Li,, et al. Nitrogen medierer blomstringstiden og effektiviteten af nitrogenbrug via blomsterregulatorer i ris, Current Biology, bind 31, udgave 4, 2021, https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.10.095. (HVIS:10,834)
[2] Jiaying Kuang, Yingchun Xu, Yidan Liu, et al. Et NnSnRK1-centreret regulatorisk netværk af skygge-induceret tidlig afbrydelse af blomstring i lotus, miljømæssig og eksperimentel botanik, bind 221,2024,105725, https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2024.105725. (HVIS:5.7)
Relaterede produkter
| Produktnavn | Kat# | Specifikation |
| Ciprofloxacin hydrochlorid | 60201ES05/25/60 | 5/25/100g |
| Ampicillin, natriumsalt | 60203ES10/60 | 10/100 g |
| Doxycyclinhyklat | 60204ES03/08/25 | 1/5/25 g |
| Chloramphenicol, USP-grad | 60205ES08/25/60 | 5/25/100g |
| Kanamycinsulfat | 60206ES10/60 | 10/100 g |
| Tetracyclin HCl Tetracyclin hydrochlorid (USP) | 60212ES25/60 | 25/100g |
| Vancomycin hydrochlorid | 60213ES60/80/90 | 100mg/1g/5g |
| Gentamycin sulfat salt | 60214ES03/08/25 | 1/5/25 g |
| Spectinomycin hydrochlorid | 60215ES08 | 5g |
| Phleomycin (20 mg/ml i opløsning) | 60217ES20/60 | 20/5×20mg |
| Blasticidin S (Blasticidin) | 60218ES10/60 | 10/10×10mg |
| Nystatin | 60219ES08 | 5g |
| G418 Sulfat (Geneticin) | 60220ES03/08 | 1/5 g |
| Puromycin (opløsning 10 mg/ml) | 60209ES10/50/60/76 | 1 × 1 / 5 × 1 / 1 0 × 1 / 50 × 1 ml |
| Puromycin dihydrochlorid | 60210ES25/60/72/76/80 | 25/100/250/500 mg / 1 g |
| Hygromycin B (50 mg/ml) | 60224ES03 | 1 g (20 ml)/10×1 g (20 ml) |
| Hygromycin B | 60225ES03/10 | 1/10 g |
| Erythromycin | 60228ES08/25 | 5/25 g |
| Timentin | 60230ES07/32 | 3,2/10×3.2g |
| Aureobasidin A (AbA) | 60231ES03/08/10 | 1/5×1/10×1 mg |
| Polymyxin B Sulfat | 60242ES03/10 | 1/10 MU |
Referencedokumentation
[1] Paiano A, et al. Gær to-hybrid assay til identifikation af interagerende proteiner. Curr Protoc Protein Sci. 2019 feb;95(1):e70.
[2] John S, et al. Gær en-hybrid assays: et historisk og teknisk perspektiv. Metoder. august 2012;57(4): 441-447.
[3] Dong H, et al. Transkriptomanalyse af sojabønne WRKY TF'er som svar på Peronospora manshurica-infektion. Genomik. 2019 Dec;111(6):1412-1422.