1 Aaktionsprincip

Hygromycin B er et aminoglykosid-antibiotikum, der produceres af metabolismen af ​​Streptomyces hygroscopicus, som hæmmer proteinsyntesen ved at forstyrre translokation og fremme fejllæsning af 80S-ribosomer og derved dræbe prokaryote og eukaryote celler.

På nuværende tidspunkt er det almindeligt anvendt til at screene og vedligeholde prokaryote eller eukaryote celler indeholdende hygromycinresistensgen.

2 Anvendelse

2.1 Screen og vedligehold kultur af prokaryote eller eukaryote celler (planteceller og pattedyrceller) stabilt transficeret med Hph+vektorer

Hygromycin B resistensgen (hyg eller hph) afledt af Escherichia coli. koder for hygromycin B phosphotransferase, som omdanner hygromycin B til et biologisk inaktivt phosphoryleret produkt, hvorved det afgiftes. I lyset af dette princip er hygromycin B en meget nyttig selekterbar markør til at screene og vedligeholde dyrkede prokaryote eller eukaryote celler, der med succes er transficeret med hygromycinresistensgen.

2.2På grund af forskellen i virkemåden bruges hygromycin B ofte i kombination med geneticin G418, bleomycin og blasticidin til at screene cellelinjer stabilt transficeret med to forskellige vektorer.

Hygromycin B har en anden virkemåde end G418 (Cat#60220ES), Bleomycin(Cat#60257ES) og Blasticidins(Cat#60218ES), så det er velegnet til brug i kombination med andre selektive antibiotika i dobbeltselektionsforsøg.

2.3 Antiviralt middel
2.4 Som anthelmintikum tilsættes det dyrefoder, og dyr opdrættes.
2.5 Screening af stabilt transficerede celler

Arbejdskoncentrationen af ​​hygromycin B, der anvendes til at screene stabile transfektanter, varierer afhængigt af celletype, medium, vækstbetingelser og cellemetabolisme. Den anbefalede koncentration er 50-1000 μg/mL. Ved den første brug af forsøgssystemet anbefales det, at den optimale screeningskoncentration bestemmes ved at etablere en kill-kurve, dvs. en dosis-respons-kurve. Generelt 50-500 μg/mL for pattedyrsceller; 20-200 μg/mL for bakterier/planteceller; 200-1000 μg/mL til svampe.

3 Protokal

3.1 Fremstilling af opbevaringsopløsning (50 mg/ml)

Vej 0,5 g hygromycin B og tilsæt 10 ml 1×PBS, pH 7,4. Efter helt opløst filtreres med et 0,22 μm filter til sterilisering. Alikvoter den steriliserede opløsning og opbevar ved -20 ℃.

3.2 Almindelig anvendt screeningskoncentration

Arbejdskoncentrationen af ​​hygromycin B til screening af stabile stammer varierer afhængigt af celletype, dyrkningsmedium, vækstbetingelser og cellemetabolisme. Det anbefales at etablere en dræbskurve (dosis-responskurve) for at bestemme den optimale screeningskoncentration for første gang. Generelt pattedyrceller: 50-500 μg/ml; Bakterie-/planteceller: 20-200 μg/mL; Svampe: 300-1000 μg/mL.

3.3 Etablering af drabskurve

【Bemærk】 For at screene stabile cellelinjer er det nødvendigt at bestemme minimumskoncentrationen af ​​antibiotika, der er i stand til at dræbe utransficerede værtsceller. Dette kan opnås ved at etablere en drabskurve (dosis-respons-kurve). Der bør arrangeres mindst fem koncentrationer.

1) Dag 1: Utransformerede celler plankes i en passende dyrkningsplade ved en celletæthed på 20-25% og dyrkes natten over.【Bemærk】 Mængden af ​​podningsceller kan øges for celler, der kræver højere tæthed for at detektere vitalitet.

2) Indstil koncentrationsgradienten inden for det passende område i henhold til celletypen. Pattedyrcelle kan indstille 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μg/mL. Fortynd Hygromycin B-opløsningen 1:10 med deioniseret vand eller PBS-buffer til 5 mg/ml. Og fortynd derefter opløsningen til den tilsvarende arbejdskoncentration i henhold til følgende tabel.

3) Dag 2: Erstat med et frisklavet medium indeholdende den tilsvarende koncentration af lægemidlet. Lav tre parallelle prøver for hver koncentration.

4) Udskift med friske medier, der indeholder lægemidler hver 3.-4. dag.

5) Levende celletællinger udføres i en fast cyklus (f.eks. hver anden dag) for at bestemme den passende koncentration for at forhindre vækst af utransficerede celler. Vælg den minimale koncentration, der dræber størstedelen af ​​celler inden for et ideelt antal dage (normalt 7-10 dage), som arbejdskoncentrationen til screening af stabil cellelinje.

3.4 Screening af stabile transficerede celler

1) 48 timer efter transfektion blev cellerne subdyrket ved hjælp af screeningsmedium indeholdende hygromycin B i passende koncentration (direkte eller fortyndet). 【Bemærk】 Antibiotika virker bedst på aktivt delende celler. Hvis cellerne er for tætte, vil antibiotikummet ikke dræbe cellerne. Opdel cellerne således, at cellerne ikke er mere end 25 % sammenflydende.

2) Skift screeningsmediet hver 3-4 dag.

3) Mål cellekolonidannelsen efter 7 dages screening. Kolonidannelse kan tage endnu en uge eller mere, afhængigt af værtscelletype, transfektion og screeningseffektivitet.

4) Vælg 5-10 resistente kloner og overfør til 35 mm cellekulturplader og dyrk i lægemiddelholdigt screeningsmedium i 7 dage.

5) Erstat med frisk medium uden medicin til dyrkning.

4 Ejendomme

Hygromycin B er et hvidt til gulbrunt pulver med en speciel lugt, letopløseligt i vand, methanol, ethanol osv., og danner let salte med mange organiske og uorganiske syrer.

5 Produktopbevaring

Opløsningen kan opbevares direkte ved 2~8 ℃ og kan opbevares i mere end 6 måneder.

6 Forsigtig

1) Cellerne transficeret med hph-genet er resistente over for hygromycin, og de transficerede celler udtrykker genet stabilt eller midlertidigt.

2) Hygromycin B-resistensgenet (hyg eller hph) blev fundet i andre stammer, herunder Streptomyces hygroscopicus og Klebsiella pneumoniae, foruden E. Coli.

7 Produktanbefaling

Yeasen giver Hygromycin B i to former, pulver (1 g/10 g, Kat#60225ES) og opløsning (50 mg/ml, Kat#60224ES).

8 Udgivet artikler med vores reagenser

[1] Zhao Q, Zheng K, Ma C, et al. PTPS letter kompartmentaliseret LTBP1 S-nitrosylering og fremmer tumorvækst under hypoxi. Mol Cell . 2020;77(1):95-107.e5. doi:10.1016/j .molcel.2019.09.018 (IF:14.548)

[2] Wu LY, Shang GD, Wang FX, et al. Dynamisk kromatintilstandsprofilering afslører regulerende roller af auxin og cytokinein i skudregenerering. Dev Cell . 2022;57(4):526-542.e7. doi:10.1016/ j.devcel.2021.12.019 (IF:12.270)
[3] Zhang TQ, Chen Y, Wang JW. En enkeltcellet analyse af Arabidopsis vegetative skudspids. Dev Cell . 2021;56(7):1056-1074. e8. doi:10.1016/j.devcel.2021.02.021 (IF:12.270)
[4] Wang FX, Shang GD, Wu LY, Xu ZG, Zhao XY, Wang JW. Chromatin Accessibility Dynamics og en hierarkisk transkriptionel regulatorisk netværksstruktur for plantesomatisk embryogenese. Dev Cell . 2020;54(6):742-757.e8. doi:10.1016/j.devcel.2020.07.003 (IF:10.092)

[5] Zhu GD, Yu J, Sun ZY, et al. Genom-dækkende CRISPR/Cas9-screening identificerer CARHSP1 ansvarlig for strålingsresistens i glioblastom. Celledød Dis . 2021;12(8):724. Udgivet 2021 21. juli. doi :10.1038/s41419-021-04000-3 (IF:8.469)
[6] Chen J, Huang Y, Tang Z, et al. Genome-Scale CRISPR-Cas9 transkriptionel aktiveringsscreening i metforminresistensrelateret gen for prostatacancer. Front Cell Dev Biol . 2021;8:616332. Udgivet 2021 26. januar. doi:10.3389/fcell.2020.616332 (IF:6.684)
[7] Jiang Z, Cui Z, Zhu Z, et al. Engineering af Yarrowia lipolytica transportere til højeffektiv produktion af biobaseret ravsyre fra glucose. Bioteknologi Biobrændstoffer . 2021;14(1):145. Udgivet 2021 27. juni. doi:10.1186/s13068-021-01996-w (IF:6.040)
[8] Liu Y, Jiang X, Cui Z, Wang Z, Qi Q, Hou J. Konstruktion af den olieholdige gær Yarrowia lipolytica til fremstilling af α-farnesen. Bioteknologi Biobrændstoffer . 2019;12:296. Udgivet 23. december 2019. doi:10.1186/s13068-019-1636-z (IF:5.452)
[9] Zhou C, Zeng Z, Suo J, et al. Manipulering af en enkelt transkriptionsfaktor, Ant1, fremmer anthocyaninakkumulation i bygkorn. J Agric Food Chem . 2021;69(18):5306-5317. doi:10.1021/acs.jafc.0c08147 (IF:5.279)

[10] Cui Z, Zheng H, Jiang Z, et al.Identifikation og karakterisering af mitokondriel replikationsoprindelse for stabil og episomal ekspression i Yarrowia lipolytica. ACS Synth Biol . 2021;10(4):826-835. doi:10.1021 /acssynbio.0c00619 (IF:5.110)

9 Relaterede produkter