Apoptose refererer generelt til en slags programmeret celledød, der sker gennem regulering af intracellulære gener og deres produkter under udviklingen af ​​celler eller under påvirkning af nogle faktorer. Apoptose spiller en vigtig rolle i embryonal udvikling og morfogenese, stabiliteten af ​​normale cellepopulationer i væv, kroppens forsvar og immunrespons, celleskade og aldring forårsaget af sygdom eller forgiftning, og forekomst og progression af tumorer, og har potentiel terapeutisk betydning.

Begivenhederne i den apoptotiske vej forekommer i en tidssekvens, det vil sige, begivenhederne forekommer i rækkefølge og fører til sidst til fremkomsten af ​​apoptotiske legemer med forekomsten af ​​apoptose.

Dens typiske egenskaber er som følger:

1. Tidlig apoptose: cellemembranstrukturændringer, phosphatidylserin eversion;

2. Tidlig og mellemstadie apoptose: tætheden af ​​cytoplasma steg, mitokondriemembranpotentialet forsvandt, permeabiliteten ændrede sig, og cytochrom C blev frigivet til cytoplasmaet;

3. Sen apoptose: apoptose signaltransduktion;

4. Sen apoptose: DNA nedbrudt til 180~200bp fragmentstørrelse.

Figur 1: Forekomst og påvisning af sekventielle hændelser i apoptosevejen

1. Tidlig apoptose: Annexin-V/PI dobbeltfarvning (påvisning af PS på den ekstracellulære membran)

I normale levende celler er fosfatidylserin (PS) placeret på indersiden af ​​cellemembranen. Når apoptose opstår, ændres cellemembranen, og PS vender fra den indre overflade af cellemembranen til den ydre overflade af cellemembranen. Annexin-V er et Ca2+-afhængigt phospholipidbindende protein med en molekylvægt på 35-36 KD, som kan binde til PS med høj affinitet. Ved at bruge Annexin-V mærket med fluorescein (FITC, Alexa fluor488 osv.) som en probe, kan apoptotiske celler og levende celler identificeres ved flowcytometri eller fluorescensmikroskop.

PS af nekrotiske celler vil også vende over fra den indre overflade af cellemembranen til den ydre overflade af cellemembranen. Annexin-V kan også genkende PS på overfladen af ​​nekrotiske celler, så Annexin-V kan ikke skelne nekrotiske celler fra apoptotiske celler. Derudover er propidiniodid (PI) et nukleinsyrefarvestof, som kan binde sig til DNA i celler, og det kan ikke trænge igennem hele cellemembranen. Cellemembranen i tidlige apoptotiske celler og levende celler er stadig intakt, og PI-farve kan ikke trænge frit ind i cellen gennem cellemembranen for at binde med DNA, så PI-farve kan ikke mærke apoptotiske celler og levende celler, men PI-farve kan binde med DNA i cellen gennem cellemembranen i nekrotiske celler. PI farvestof i de døde celler vil udsende rød fluorescens efter at være blevet exciteret af 488nm laser, og vil blive modtaget af den tilsvarende kanal. Derfor kan Annexin V og PI bruges sammen til at skelne mellem levende celler, tidlige apoptotiske celler og nekrotiske celler.

Figur 2: Analyse af flowcytometriresultater efter annexin-v/pi dobbeltfarvning

Bestilling af produkter:

2. Tidlig apoptose: JC-1-farvning (påvisning af mitokondrielle membranpotentiale ændringer)

Processen med apoptose er ofte ledsaget af ødelæggelsen af ​​mitokondrielt transmembranpotentiale, som i vid udstrækning anses for at være en af ​​de tidligste begivenheder i processen med apoptosekaskaden. Det sker før udseendet af egenskaberne ved nuklear apoptose (kromatinkoncentration, DNA-brud). Når mitokondrielle transmembranpotentiale kollapser, er celleapoptose irreversibel. Eksistensen af ​​mitokondrielt transmembranpotentiale gør det muligt for nogle lipofile kationiske fluorescerende farvestoffer såsom rhodamin 123, JC-1, JC-10 at binde til mitokondriematrixen. Forøgelsen eller faldet af deres fluorescens indikerer stigningen eller faldet i elektronegativiteten af ​​den mitokondrielle indre membran.

JC-1 bruges i vid udstrækning til at detektere mitokondrielt membranpotentiale △ΨM, hvilket viser potentialeafhængig akkumulering i mitokondrier. I normale mitokondrier aggregerer JC-1 i mitokondriematrixen og danner en polymer, som udsender kraftig rød fluorescens (ex=585 nm, em=590 nm); I apoptotiske celler depolariserede mitokondrielle transmembranpotentiale, JC-1 blev frigivet fra mitokondrier, koncentrationen faldt og vendt til monomerformen, der udsendte grøn fluorescens. Derfor afspejler ændringen af ​​farve direkte ændringen i mitokondriel membranpotentiale. Graden af ​​mitokondriel depolarisering kan også måles ved forholdet mellem rød/grøn fluorescensintensitet. JC-1-detektion er en almindelig metode.

3. Sen apoptose: TUNEL-metode (DNA-fragment in situ-mærkningsmetode)

På det sene stadium af apoptose produceres et stort antal klæbrige 3-OH-terminaler på grund af dobbeltstrengsbrud eller enkeltstrengsbrud af kromosomalt DNA. Under påvirkning af deoxyribonukleotidterminal transferase (TdT) kan luciferasemærket dUTP bindes til den 3-terminale DNA, således at apoptotiske celler kan påvises, sådanne metoder kaldes terminal deoxynukleotidyltransferasemedieret dUTP nick end-mærkning (TUNEL). Fordi normale eller prolifererende celler næsten ikke har DNA-brud, er der ingen 3-OH-dannelse, og få kan farves. TUNEL er faktisk en forskningsmetode, der kombinerer molekylærbiologi og morfologi. In situ farvning af en komplet enkelt apoptotisk kerne eller apoptotisk krop kan nøjagtigt afspejle de typiske biokemiske og morfologiske karakteristika ved apoptose. Det kan bruges til at bestemme cellemorfologien af ​​paraffinindlejrede vævssektioner, frosne vævssnit, dyrkede celler og celler isoleret fra væv og kan detektere et meget lille antal apoptotiske celler, derfor er det meget brugt i studiet af apoptose.

Relaterede produkter: