Puromycin er et aminoglykosid-antibiotikum produceret af Streptomyces alboniger. Det er en analog af 3'-enden af aminoacyl-tRNA-molekylet og kan binde til A-stedet af ribosomet, inkorporere i den forlængede peptidkæde, forstyrre peptidtranslokation på ribosomet, forårsage for tidlig kædeterminering under translation og dermed hæmme proteinsyntese.
Figur 1 Strukturformel for Puromycin (CAS-NR. 53-79-2)
Pac-genet, der koder for puromycin N-acetyltransferase (pac), blev fundet i den Puromycin-producerende bakterie Streptomyces alboniger, hvilket giver resistens over for puromycin. Denne egenskab er nu almindeligt anvendt til at screene pattedyrsstabile transficerede cellelinjer, der bærer plasmider med pac-genet. Den udbredte anvendelse af puromycin til screening af stabile cellelinjer er relateret til egenskaberne af lentivirale vektorer, hvoraf de fleste bærer pac-genet i kommercielle lentivirale vektorer. I visse specifikke tilfælde kan puromycin også anvendes til at screene E. coli-stammer transformeret med plasmider, der bærer pac-genet. Puromycin virker hurtigt og kan hurtigt forårsage celledød ved lave koncentrationer. Adhærente pattedyrsceller er følsomme over for koncentrationer på 2-5 µg/mL af puromycin, mens suspensionsceller allerede er følsomme over for koncentrationer så lave som 0,5-2 µg/mL puromycin. Pattedyrceller med stabil resistens over for puromycin kan genereres inden for en uge.
Screening af stabil cellelinje
Eksperimentelt princip
Ved at klone eksogent DNA/shRNA ind i en vektor, der bærer pac-genet, transficeres den rekombinante vektor ind i værtsceller og integreres i deres kromosomer, transmitteres stabilt med celledeling og screenes til sidst med puromycin.
Forberedelse og præ-eksperiment
1 Anbefalede brugskoncentrationer
Pattedyrceller: 1-10 μg/mL, den optimale koncentration skal bestemmes ved præ-eksperiment.
E.coli: Til screening af stabile transformerede E. coli, der bærer pac-genet på LB-agarmedium, skal du bruge en koncentration på 125 μg/mL. Præcis pH-justering er nødvendig for puromycinscreening af E. coli-stabile transformanter.
2 Opløsningsmetode
Opløs puromycin i destilleret vand for at fremstille en 50 mg/mL stamopløsning, filtersteriliser med et 0,22 μm filter, alikvot og opbevar ved -20°C.
3 Bestemmelse af Puromycin Kill Curve (ved hjælp af shRNA-transfektion eller lentiviral transduktion som eksempel)
Den effektive screeningskoncentration af puromycin er relateret til celletype, vækststatus, celletæthed, cellemetabolisme og cellecykluspositionen. Det er afgørende at bestemme minimumskoncentrationen af puromycin, der dræber ikke-transficerede celler. Det er essentielt at udføre et Puromycin-gradient-screeningspræ-eksperiment til det første eksperiment for at etablere en dræbskurve.
- Pladeceller med en tæthed på 5~8×104celler/brønd i en 24-brønds plade og dyrkning natten over.
- Forbered screeningsmedium: Frisk medium indeholdende forskellige koncentrationer af puromycin (f.eks. 0-15 μg/mL, mindst 5 gradienter).
- Udskift med frisklavet screeningsmedium, fortsæt dyrkningen, og observer cellevækst, skift det friske screeningsmedium hver 2.-3. dag.
- Observer celleoverlevelse dagligt; den lægemiddelkoncentration, der effektivt dræber alle ikke-transficerede celler inden for 4-6 dage, er minimumskoncentrationen.
Screening af stabile transfektanter
- Efter lentiviral infektion i 48-72 timer (70-80% konfluens), kulturceller i medium indeholdende en passende koncentration af Puromycin i mindst 48 timer. Når alle celler i den ikke-transficerede kontrolgruppe med puromycin dør, er de resterende celler i den virusinficerede gruppe alle positive celler.
【Bemærk】: ① Effekten af antibiotika er mest udtalt, når celler er i en aktiv delingsfase. Effekten af antibiotika vil blive væsentligt reduceret, hvis cellerne er for tætte. Celletætheden bør ikke overstige 25%. ② Observer cellevækststatus dagligt; puromycinscreening kræver mindst 48 timer, og den effektive koncentration af puromycinscreening varer normalt fra 3 til 10 dage. Jo højere MOI af virussen, jo flere kopier af shRNA og puromycinresistensgen indeholder hver celle. Når man udfører puromycinscreening, jo højere MOI, jo flere pac-kopier indeholder cellerne, og jo højere koncentration af puromycin kan de tolerere. Juster koncentrationen af puromycin for at screene transficerede celler, men koncentrationen af puromycin bør ikke være lavere end den minimale effektive koncentration af dræbskurven;
- Tilsæt dyrkningsmedium indeholdende minimumskoncentrationen af Puromycin for at udvide cellerne, og efter qPCR-testresultaterne er kvalificeret, fortsæt med kryokonservering.
| Produkts navn | Kat# | Specifikation | Udseende |
| Puromycin Dihydrochlorid CAS:58-58-2 | 60210ES25 | 25 mg | Hvidt til et hvidt-lignende pulver |
| 60210ES60 | 100 mg | ||
| 60210ES72 | 250 mg | ||
| 60210ES76 | 500 mg | ||
| 60210ES80 | 1 g | ||
| Puromycin (Opløsning 10 mg/ml) CAS:58-58-2 | 60209ES10 | 1×1 ml | Opløsning (10 mg/ml i H2O) |
| 60209ES50 | 5×1 ml | ||
| 60209ES60 | 10×1 ml | ||
| 60209ES76 | 50×1 ml |
Produktanbefaling
Publikationer fra kunder, der bruger dette produkt (delstatistik: nogle)
[1] Zhang D, Liu Y, Zhu Y, et al. En ikke-kanonisk cGAS -STING-PERK-vej letter det translationelle program, der er afgørende for senescens og organfibrose. Nat Cell Biol . 2022;24(5):766- 782. doi:10.1038/s41556-022-00894-z (IF:28.824)
[2] Lu T, Zhang Z, Zhang J, et al. CD73 i små ekstracellulære vesikler afledt af HNSCC definerer tumorassocieret immunsuppression medieret af makrofager i mikromiljøet. J Ekstracelle-vesikler . 2022;11(5):e12218. doi:10.1002/jev2.12218 (IF:25.841)
[3] Meng F, Yu Z, Zhang D, et al.Induceret faseadskillelse af mutant NF2 fængsler cGAS-STING-maskineriet for at ophæve antitumorimmunitet. Mol Cell . 2021;81(20):4147-4164.e7.doi: 10.1016/j.molcel.2021.07.040 (IF:17.970)
[4] Chen S, Liu S, Wang J, et al. TBK1-medieret DRP1-målretning giver nukleinsyresensing til omprogrammering af mitokondriel dynamik og fysiologi. Mol Cell . 2020;80(5):810-827.e7.doi:10.1016 /j.molcel.2020.10.018 (IF:15.584)
[5] Zhao Q, Zheng K, Ma C, et al. PTPS letter kompartmentaliseret LTBP1 S-nitrosylering og fremmer tumorvækst under hypoxi. Mol Cell . 2020;77(1):95-107.e5. doi:10.1016/j.molcel.2019.09.018 (IF:14.548)
[6] Mo J, Liu F, Sun X, et al. Hæmning af FACT-komplekset retter sig mod afvigende pindsvin-signalering og overvinder modstand mod udjævnede antagonister. Cancer Res . 2021;81(11):3105-3120. doi:10.1158/0008-5472.CAN-20-3186 (IF:12.701)
[7] Zou Y, Wang A, Shi M, et al. Analyse af redoxlandskaber og dynamik i levende celler og in vivo ved hjælp af genetisk kodede fluorescerende sensorer. Nat Protoc . 2018;13(10):2362-2386. doi:10.1038/s41596-018-0042-5 (IF:12.423)
[8] Mao L, Chen J, Lu X, et al. Proteomisk analyse af lungekræftceller afslører en kritisk rolle for BCAT1 i cancercellemetastaser. Teranostik. 2021;11(19):9705-9720. Udgivet 2021 27. sep. doi:10.7150/thno.61731 (IF:11.556)
[9] Han L, Zhang F, Liu Y, et al. Uterus globulin-associeret protein 1 (UGRP1) binder podoplanin (PDPN) for at fremme en ny inflammationsvej under Streptococcus pneumoniae-infektion. Clin Transl Med. 2022;12(6):e850. doi:10.1002/ctm2.850 (IF:11.492)
[10] Zhang M, Liu F, Zhou P, et al. MTOR-signalvejen regulerer makrofagdifferentiering fra muse-myeloid-progenitorer ved at hæmme autofagi. Autofagi . 2019;15(7):1150-1162. doi:10.1080/15548627.2019. 1578040 (IF:11.059)
[11] Zhang S, Yang Z, Bao W, et al. SNX10 (sortering af nexin 10) hæmmer initiering og progression af kolorektal cancer ved at kontrollere autofagisk nedbrydning af SRC. Autofagi . 2020;16(4):735 -749. doi:10.1080/15548627.2019.1632122 (IF:11.059)
[12] Zhang Y, Ding H, Wang X, et al. MK2 fremmer Tfcp2l1-nedbrydning via β-TrCP ubiquitin-ligase for at regulere museembryonale stamcelle-selvfornyelse. Cell Rep . 2021;37(5):109949. doi:10.1016/j.celrep.2021.109949 (IF:9.423)
[13] Jiang Y, Dong Y, Luo Y, et al. AMPK-medieret phosphorylering på 53BP1 fremmer c-NHEJ. Cell Rep . 2021;34(7):108713. doi:10.1016/j.celrep.2021.108713 (IF:9.423)
[14] Sun Q, Ye Y, Gui A, et al. MORTALIN-Ca 2+ akse driver medfødt rituximab-resistens i diffust storcellet B-celle lymfom. Cancer Lett . 2022;537:215678. doi:10.1016/j.canlet.2022.215678 (IF:8.679)
[15] Jin R, Zhao A, Han S, et al. Interaktionen mellem S100A16 og GRP78 aktiverer endoplasmatisk retikulum-stress-medieret gennem IRE1α/XBP1-vejen i renal tubulointerstitiel fibrose. Celledød Dis . 2021;12(10):942. Udgivet 13. oktober 2021. doi: 10.1038/s41419-021-04249-8 (IF:8.469)
[16] Zhang P, Zhang Z, Fu Y, et al.K63-koblet ubiquitinering af DYRK1A lindrer ved TRAF2 Sprouty 2-medieret nedbrydning af EGFR. Celledød Dis . 2021;12(6):608. Udgivet 11. juni 2021. doi:10.1038/s41419-021-03887-2 (IF:8.469)
[17] Zhao T, Li Y, Shen K, Wang Q, Zhang J. Knockdown af OLR1 svækker glykolytisk metabolisme for at undertrykke tyktarmskræftcelleproliferation og kemoresistens ved at nedregulere SULT2B1 via c-MYC. Celledød Dis. 2021;13(1):4. Udgivet 17. december 2021. doi: 10.1038/s41419-021-04174-w (IF:8.469)
[18] Zhou R, Wu Q, Wang M, et al. Proteinet phosphatase PPM1A dephosphorylerer og aktiverer YAP til at styre pattedyrs tarm- og leverregenerering. PLoS Biol . 2021; 19(2):e3001122. Udgivet 2021 25. februar doi:10.1371/journal.pbio.3001122 (IF:8.029)
[19] Wu S, Wang S, Lin X, Yang S, Ba X, Xiong D, Xiao L, Li R. Lanatoside C hæmmer herpes simplex virus 1 replikation ved at regulere NRF2 distribution i celler. Fytomedicin. 2024 feb;124:155308. doi: 10.1016/j.phymed.2023.155308. (HVIS:7.9)
[20] Shen K, Song W, Wang H, Wang L, Yang Y, Hu Q, Ren M, Gao Z, Wang Q, Zheng S, Zhu M, Yang Y, Zhang Y, Wei C, Gu J. Afkodning af det metastatiske potentiale og optimal postoperativ adjuverende terapi af melanom baseret på metastase-score. Celledød Discover. 2023 25. okt;9(1):397. doi: 10.1038/s41420-023-01678-6. (HVIS:7.0)
Relaterede produkter
| Produktnavn | Kat# | Specifikation |
| Ciprofloxacin hydrochlorid | 60201ES05/25/60 | 5/25/100g |
| Ampicillin, natriumsalt | 60203ES10/60 | 10/100 g |
| Doxycyclinhyklat | 60204ES03/08/25 | 1/5/25 g |
| Chloramphenicol, USP-grad | 60205ES08/25/60 | 5/25/100g |
| Kanamycinsulfat | 60206ES10/60 | 10/100 g |
| Tetracyclin HCl Tetracyclin hydrochlorid (USP) | 60212ES25/60 | 25/100g |
| Vancomycin hydrochlorid | 60213ES60/80/90 | 100mg/1g/5g |
| Gentamycin sulfat salt | 60214ES03/08/25 | 1/5/25 g |
| Spectinomycin hydrochlorid | 60215ES08 | 5g |
| Phleomycin (20 mg/ml i opløsning) | 60217ES20/60 | 20/5×20mg |
| Blasticidin S (Blasticidin) | 60218ES10/60 | 10/10×10mg |
| Nystatin | 60219ES08 | 5g |
| G418 Sulfat (Geneticin) | 60220ES03/08 | 1/5 g |
| Puromycin (opløsning 10 mg/ml) | 60209ES10/50/60/76 | 1 × 1 / 5 × 1 / 1 0 × 1 / 50 × 1 ml |
| Puromycin dihydrochlorid | 60210ES25/60/72/76/80 | 25/100/250/500 mg / 1 g |
| Hygromycin B (50 mg/ml) | 60224ES03 | 1 g (20 ml)/10×1 g (20 ml) |
| Hygromycin B | 60225ES03/10 | 1/10 g |
| Erythromycin | 60228ES08/25 | 5/25 g |
| Timentin | 60230ES07/32 | 3,2/10×3.2g |
| Aureobasidin A (AbA) | 60231ES03/08/10 | 1/5×1/10×1 mg |
| Polymyxin B Sulfat | 60242ES03/10 | 1/10 MU |