Om T4 DNA Ligase
Fig. 1 Skematisk diagram af reaktionsprincippet for T4 DNA-ligase[1]
Iterativ våd og tør eksperimentel screening for at opnå højtydende T4 DNA Ligase
T4 DNA-ligase, et ATP-afhængigt ligaseenzym, omfatter et kompakt-spiralformet DNA-bindende domæne (DBD), et nukleotidyl-transferase (NTase) domæne og et OB-fold domæne. Baseret på proteinstrukturen, Yeasens hold analyserede resterne, der spænder over afstande på 5 til 20Å omkring DNA-substratet, efterfulgt af silico-screening og struktur-funktionsanalyse ved hjælp af avancerede beregningsværktøjer. Under denne proces, teamet observerede en fleksibel løkke placeret fjernt fra den aktive lomme. Styret af energiberegninger, teamet designede trunkeringer i denne loop-region, idet den antager, at det muligvis ikke påvirker ligeringsfunktionen signifikant, men kunne påvirke den overordnede strukturelle stabilitet. Desuden holdet tilpassede konsensussekvenser til at designe mutanter, der kobler denne analyse med strukturelle-funktionelle overvejelser, som illustreret i figuren nedenfor.
Udover rationelt design blev den rettede udvikling af T4 DNA-ligase udført med MTPS-metoden ved at screene stabiliteten, aktiviteten og resterende aktivitet. Og et bibliotek på over 104 mutanter blev screenet. Efter en grundig analyse af mutationsdata blev lovende kandidater udvalgt til oprensning og streng test. Derefter blev alle vinderne opnået ved rationelt design og rettet evolution gennemgået detaljeret karakterisering efter raffineret oprensning, omfattende vurderinger af aktivitet, stabilitet, adaptor-selv-ligering, DNA-fragment-selv-ligering og DNA-udbytte. Baseret på G1 mutanter, holdet udførte DNA-shuffling og kombineret rettet mutationsdesign for at få exceptionelle mutanter, der imødekommer forskellige anvendelseskrav.
Fra mutant til markedsprodukt med flere runder af sekventeringsvalidering
De Zyme EditorTM enzymevolutionsplatformen har med succes udviklet en T4 DNA-ligasemutant med høj termisk stabilitet, højt biblioteksudbytte og lav adapterselvligering gennem enzymevolutionsteknologi. Den i øjeblikket forbedrede T4 DNA Ligase er blevet lanceret med succes - Hieff® Versatile T4 DNA Ligase (600 U/μL) (Cat#12996ES). Dette produkt udkonkurrerer den traditionelle vildtype T4 DNA Ligase med hensyn til ligeringseffektivitet og termisk stabilitet, og det er blevet verificeret ved high-throughput sekventering, hvilket sikrer fremragende kvalitet.
Datapræsentation
1. Højere termisk stabilitet
T4 DNA Ligase mutanterne fra Yeasen blev udsat for varmebehandling ved 42 ℃ i 0, 2 og 4 timer og blev sammenlignet med T4 DNA-ligaser fra leverandør Q, N, A og T.Efterfølgende blev et hel-genom DNA-bibliotek konstrueret under anvendelse af 1 µg fragmenteret bovint gDNA med Yeasen DNA Library Construction Kit (Cat#12927ES) for at sammenligne den termiske stabilitet af T4 DNA Ligase.
Fig 3 Termisk stabilitetstest ved 42℃
Resultater:
Termisk stabilitet: Yeasen ≈ Leverandør N ≈ Leverandør A > Leverandør T > Leverandør Q.
2. Højere biblioteksudbytte
T4 DNA Ligase-mutanten fra Yeasen blev testet for biblioteksudbytte ved både høje og lave DNA-input-niveauer sammenlignet med T4 DNA-ligaser fra leverandør Q, N, A og T. Yeasen DNA Library Construction Kit (kat#12927ES) blev brugt, hvor 1 µg og 0,5 ng af gDNA-konstruerede kvægbiblioteker blev inputtet.
3. Nedre adapter selvligation
T4 DNA Ligase-mutanten fra Yeasen blev sammenlignet med T4 DNA-ligaser fra sælger Q, N, A og T til adapterselvligering. Yeasen DNA Library Construction Kit (Cat#12927ES) blev brugt, hvor 0 ng og 0,5 ng fragmenteret bovint gDNA blev input til at konstruere hel-genom DNA-biblioteker.
Kontakt os
Yeasen har med succes overvundet begrænsningerne ved traditionelle T4 DNA-ligaser og tilbyder et T4 DNA-ligaseprodukt, der udmærker sig i termisk stabilitet, biblioteksudbytte og adapterselvligering. I denne proces har virksomheden akkumuleret et rigt bibliotek af mutanter, der giver forskere en række muligheder for at imødekomme forskellige eksperimentelle behov. Hvis du er interesseret i vores produkter eller T4 DNA-ligasemutanter, er du velkommen til at kontakte os via følgende metoder.Yeasen T4 DNA Ligase produktserie
| produktpositionering | Produktnavn | Kat. Ingen. |
| Høj termisk stabilitet og lav selvligeringshastighed | Hieff® Alsidig T4 DNA Ligase (600 U/μL) | 12996ES |
| Hurtig og effektiv ligering, lav restkoncentration, perfekt egnet til behov for påvisning af patogener. | Hurtig T4 DNA Ligase (400 U/µL) | 10299ES |
| universel model | Hurtig T4 DNA Ligase (400 U/µL) | 10301ES |
Referencer
[1] Shuman S .DNA Ligases: Fremskridt og udsigter[J].Journal of Biological Chemistry, 2009, 284(26):17365-17369.