RNase HII, også kendt som RNase H2, er en endoribonuklease, der specifikt retter sig mod og adskiller phosphodiesterbindingen ved 5'-enden af ​​et ensomt ribonukleotid, der ligger i en dobbeltstrenget DNA-helix, hvilket giver en 5'-phosphat- og en 3'-hydroxylgruppe (Fig. hydroxylgruppe). Dette enzym udviser minimal spaltningsaktivitet over for enkeltstrenget RNA og er inaktivt mod både dobbeltstrenget DNA (dsDNA) og enkeltstrenget DNA (ssDNA). Funktionelt aktiv inden for temperaturområdet 50°C til 75°C, RNase HII når topydelse ved temperaturer mellem 70°C og 75°C. Ved at udnytte sin unikke evne til at udføre målrettet, single-site spaltning på DNA-steder, hvor et ribonukleotid er integreret, uden at påvirke dsDNA eller ssDNA, tjener RNase HII som en præcisions "trigger" for reaktionsinitiering, herunder primeraktivering og forlængelse, for at opnå specifik amplifikation. Dette enzym spiller en central rolle i RNase H-afhængig PCR (rhPCR), loop-medieret isotermisk amplifikationsteknologi (LAMP) og nedbrydningen af ​​RNA-komponenter i Okazaki-fragmenter.

一. RNase H-afhængig PCR(rhPCR)
rhPCR inkorporerer RNase HII og specialdesignede, lukkede spaltelige rhPCR-primere i PCR-processen. Denne tilgang udnytter den unikke egenskab ved RNase HII til selektivt at hydrolysere RNA i DNA-RNA-hybrider, mens phosphodiesterbindingerne i enkeltstrenget eller dobbeltstrenget DNA og RNA efterlades intakt. Som et resultat fordøjer RNase HII kun DNA-RNA-hybriden og tillader primerforlængelse, når primeren er perfekt komplementær til mål-DNA-sekvensen. Denne målrettede handling forbedrer reaktionens nøjagtighed markant. RNase HII er det eneste enzym, der er i stand til at starte den præcise fjernelse af ribonukleotider uden at inducere mutationer ved at spalte i 5'-enden af ​​ribonukleinsyre. På grund af dens høje specificitet, sensitivitet og reproducerbarhed tilbyder rhPCR klare fordele i applikationer såsom enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) påvisning, gentypebestemmelse, samtidig påvisning af flere mål og miljømæssig nukleinsyreanalyse.

Teknisk rute

1. Primer Design

Primerdesign skal sikre, at smeltetemperaturen efter skæring er højere end annealingstemperaturen for at sikre, at primeren binder stabilt til skabelonen under PCR-cyklusser. rhPCR-primeren består af tre dele:

1）5' DNA-segment: Sammenlignelig i længde og smeltetemperatur (Tm) krav til standard PCR-primere, kan det effektivt parres med og strække sig fra template-DNA'et efter at være blevet skåret af RNase HII-enzym.

2) En enkelt RNA-base: giver et skæringssted for RNase HII.

3）3' DNA-segment: En længde på fire eller fem baser med en blokker, typisk et kort, ikke-udvideligt molekyle såsom propylenglycol, som forhindrer forlængelsen af ​​DNA-polymerase, indtil blokkeren er fjernet.

2.Skæring og forlængelse

Ved starten af ​​rhPCR-reaktionen er primeren og template-DNA'et frie. Når primeren binder til den specifikke RNA:DNA-heteroduplex-skabelon, genkendes og skæres RNA-basen 5'-siden af ​​den blokerede primer af RNase HII-enzym, hvilket efterlader et DNA-oligonukleotid med en 3'-hydroxylgruppe, hvilket giver et udgangspunkt for DNA-polymerase at udvide. Dette efterfølges af den konventionelle PCR-amplifikationsproces.

Fig. 2. Diagram over rhPCR-princippet ^[1]

二.Loop-medieret isotermisk amplifikation (LAMP)

Loop-medieret isotermisk amplifikation (LAMP) er en enkel og hurtig metode til genamplifikation, der kan amplificere nukleinsyrer under isotermiske forhold på kort tid. Men på grund af initieringen af ​​DNA-polymeraseaktivitet under fremstillingen ved stuetemperatur, dannes der ikke-specifikke mismatches, hvilket kan føre til en lille mængde fejlparring og primer-dimere, hvilket forårsager mindre kontamineringer, der kan resultere i falske positiver.
Anvendelse af RNase HII til LAMP-amplifikationssystemet kan effektivt løse problemet med falske positiver i LAMP-teknologi, hvilket udvider dets anvendelse i klinisk diagnostik. Som vist i fig. 3, den primer-aktiverede LAMP-metode (PA-LAMP) ved anvendelse af RNase HII, når primeren parrer sig med target-ssDNA'et, spalter RNase HII-enzymet specifikt RNA'et på primeren, aktiverer det og tillader primerforlængelse, opnår specifik amplifikation og effektivt reducerer det falske system.

YEASEN RNase HII

YEASEN's RNase HII (Kat #14539) er afledt af Pyrococcus abyssi, Pa, og det er fri for kontaminerende nukleaser, nicking-enzymer og RNase-rester, med lav værts-DNA-kontamination, hvilket effektivt reducerer falske positiver i systemet. YEASENs RNase HII er ekstremt varmebestandig og bevarer sin aktivitet selv efter 30 minutter ved 95°C, hvilket gør den kompatibel med forskellige rhPCR-reaktionssystemer og også velegnet til LAMP og andre applikationer.

1. E. coli genomisk DNA-rest < 0,5 kopier/100 U

Påvisning af E. coli genomisk DNA-rest i forskellige partier af RNase HII viste, at den genomiske værts-DNA-rest af YEASENs RNase HII er langt under 0,5 kopier/100 U.

Fig 4. Detektion af E. coli genomisk DNA-rest

2. 95°C varmebestandighedstest

Efter opvarmning af RNase HII ved 95°C i 0 til 45 minutter blev enzymaktiviteten af ​​RNase HII testet. Resultaterne indikerede, at der næsten ikke var noget tab af enzymaktivitet i YEASEN's RNase HII, selv efter 45 minutters opvarmning.

Fig. 5. 95°C varmemodstandstest

3. Ingen exonuklease., Nicking-enzym eller RNase-rest (1 U-dosis)

Inkubering af 1 U af forskellige batches af RNase HII med deres respektive substrater DNA/RNA ved 37°C i 4 timer, viste resultaterne af agarosegelelektroforese, at der ikke var nogen exonuklease, nicking-enzym eller RNase-rest i RNase HII.

Fig 6.Påvisningsresultater af exonuklease, nicking-enzym og RNase-rest

Anbefalede relaterede produkter

Produktanvendelse	Produktnavn	Katalognummer
rhPCR, LAMPE	RNase HII(2 U/μL) RNase HII, Glycerolfri (2 U/μL)	14539ES 14541ES
rhPCR	Hieff® Taq DNA-polymerase	10101ES
RT-LAMPE	Hieff® Bst Plus DNA-polymerase (40 U/μL)	14402ES
	Hifair® Ⅲ Omvendt transkriptase	11111ES

Referencer

[1] Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Rupp SM, Powers KM, Behlke MA, Walder JA. RNase H-afhængig PCR (rhPCR): forbedret specificitet og enkelt nukleotid polymorfi detektion ved brug af blokerede spaltelige primere. BMC Biotechnol. 2011 Aug 10;11:80. doi: 10.1186/1472-6750-11-80.

[2] Du WF, Ge JH, Li JJ, et al. Enkelttrins, højspecificitetspåvisning af enkeltnukleotidmutation ved primeraktiverbar loop-medieret isotermisk amplifikation (PA-LAMP)[J].Analytica chimica acta, 2019(1050-):1050.DOI:10.1016/j.aca.2018.10.068.