Med den hurtige udvikling af srotein science har proteinrensningsteknologi en stadig vigtigere rolle inden for biologisk forskning og bioteknologisk industri. Som en kerneteknik involverer det integration af kodningsinformationen af målproteinet i værtscellerne gennem genteknologiske metoder, så de kan induceres til effektivt at producere de nødvendige proteiner. Efterfølgende udføres en række sofistikerede in vitro-operationstrin for at opnå høj-ren ekstraktion af proteiner. Proteinrensning gør det muligt for forskere at isolere enkelte typer proteiner, hvilket er afgørende for dybdegående undersøgelser af proteiners struktur og funktion, udvikling af nye lægemidler, sygdomsdiagnostik og fremme af anvendelsen af bioteknologi. Denne teknologi sikrer ikke kun nøjagtigheden af videnskabelige eksperimenter, men driver også løbende udviklingen af biovidenskab.
Figur 1. Skematisk diagram af affinitetskromatografi[1]
Inden for proteinteknologi fungerer fusionstags som et kraftfuldt værktøj, som kan lette forskellige eksperimentelle formål ved at binde sig til målproteinerne. Funktionerne af almindelige fusionsmærker er angivet i tabellen nedenfor til reference. Men når først disse tags forbliver på fusionsproteinerne efter at have opfyldt deres indledende hjælpefunktioner, kan de have negative virkninger på efterfølgende eksperimenter, såsom at interferere med dyreimmunologiske eksperimenter eller påvirke proteiners biologiske aktivitet. Derfor er det afgørende at fjerne disse unødvendige fusionstags for at sikre proteinernes normale funktion og eksperimenternes nøjagtighed.
Tabel 1. Introduktion til funktionerne af almindelige fusionsmærker og enzymspaltningsmetoder
| Fusion tag | Størrelse (KD-en) | Fungere | Almindelige enzymatiske spaltningsmetoder |
| Hans | 0,84 | Fordelagtig til oprensning, i stand til at oprense opløselige/inklusionskropsproteiner. | TEV Protease |
| Flag | 1.01 | Formålet med protein fusioneret med Fforsinkelse tag kan genkendes af antistoffet mod Fforsinkelse, således at fusionsproteinet indeholdende Fforsinkelse tag kan detekteres og identificeres ved Western Blot, ELISA og andre metoder. | Enterokinase |
| moms | 26 | Forbedre proteinopløseligheden, kun i stand til at rense opløselige proteiner og beskytte giftige proteiner. | Thrombin |
| MBP | 44,4 | Forbedre proteinopløseligheden og beskytter giftige proteiner. | TEV Protease |
| NusA | 55 | Forbedre proteinopløseligheden og beskytter giftige proteiner. | Thrombin |
| SUMO | 11.2 | Forbedre opløseligheden af proteiner, fremme protein fra proteolytisk hydrolyse og forbedre stabiliteten af proteiner. | SUMO Protease |
I dag er vi glade for at kunne præsentere dig for et banebrydende produkt til effektiv og præcis fjernelse af fusionsmærker - UCF.METM rTEV Protease. Med sin enkle og nemme at betjene eksperimentelle procedure kan dette enzym bekvemt spalte unødvendige tags fra fusionsproteiner og derved opnå målproteiner med høj renhed.
UCF.METM rTEV Protease
TEV Protease er en protease, der i vid udstrækning anvendes til spaltning af rekombinante proteinfusionsmærker, kendt for sin høje sitespecificitet. Den genkender strengt syv-aminosyresekvensen EXXYXQ↓(G/S) og udfører præcis spaltning mellem glutamin og glycin eller serin. Den mest almindelige syv-aminosyresekvens er Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓-Gly. Denne specificitet sikrer nøjagtigheden og effektiviteten i proteinbehandlingsproceduren.
Figur 2. Skematisk diagram af virkningsmekanismen for TEV-protease[2]
UCF.METM rTEV Protease er en rekombinant protease, der er blevet gensplejset og fint oprenset. Det bevarer ikke kun den fulde funktionelle aktivitet af det naturlige TEV-enzym, men udviser også fremragende stabilitet og specificitet over et bredere temperaturområde. De vært gDNA-rest af thans produkt er meget lav, hvilket sikrer højere skæreeffektivitet af proteinfusionstags i praktiske anvendelser og reducerer effektivt risikoen for at introducere eksogene stofrester. UCF.METM rTEV Protease udviser optimal aktivitet under betingelserne pH 7,0 og 30°C. Det bevarer imidlertid aktiviteten selv under en lang række forhold med pH 6,0-8,5 og temperatur 4-30°C, for at opfylde de forskellige proteinbehandlingskrav. Det er værd at nævne, at UCF.METM rTEV-protease har et 6×His-tag ved sin N-terminal, som effektivt kan fjernes af Ni-NTA-harpiks, hvorved der opnås præcis oprensning af målproteinet.
Ydeevne display
1. Høj spaltningseffektivitet: Proteinmærket spaltes mere grundigt
Brug af fusionsproteinet (3 μg) indeholdende UCF.METM rTEV Protease-spaltningssted som substrat, UCF.METM rTEV-protease ved henholdsvis 10, 5 og 3 U blev tilsat, og reaktionen blev udført ved 30°C i 1 time. Spaltningseffekten blev påvist ved agarosegelelektroforese. Resultaterne viste, at Ylempe's UCF.METM rTEV Protease kunne spalte substratet effektivt, når inputmængden var mere end 3 U, med en spaltningseffektivitet på >90%.
Figur 3. Verifikation af spaltningsaktiviteten af UCF.METM rTEV Protease
2. Lav værts-gDNA-rest: Reducerer effektivt risikoen for at introducere eksogene stofrester
Ved at teste værten (E. coli) gDNA-rester i forskellige batches af UCF.METM rTEV-protease viste resultaterne, at værtens gDNA-rest af UCF.METM rTEV Protease var langt under <1 kopi/U.
Figur 4. Resultaterne af værts-gDNA-rest i UCF.METM rTEV Protease
3. Brede anvendelsesbetingelser: I stand til at opfylde forskellige proteinbehandlingskrav.
Ved at verificere spaltningsaktiviteten af UCF.METM rTEV Protease under forskellige forhold viste resultaterne, at UCF.METM rTEV Protease havde stærk aktivitet under betingelserne 4-30°C, hvilket kunne opfylde kundernes forskellige anvendelseskrav.
| Reaktionstid (h) | Spaltningsaktivitet under forskellige temperaturer (%) | |||
| 4℃ | 16℃ | 21℃ | 30℃ | |
| 1 | 34 | 58 | 56 | 85 |
| 2 | 58 | 80 | 78 | 90 |
| 3 | 71 | 99 | 99 | 99 |
| 3.5 | 84 | 99 | 99 | 99 |
Ylempe's anbefalede fusion tag skære proteinprodukter
| Produkt Navn | Produkt Number | |
| TEV Protease | UCF.METM rTEV Protease | 20427ES |
| Enterokinase | Enterokinase, rekombinant | 20395ES |
| SUMO Protease | SUMO Protease | 20410ES |
| 3C protease | 3C protease | 20409ES |
Referencer:
[1] Parikh I, Cuatrecasas P. Affinity Chromatography[J].Vox Sanguinis, 1972, 23(1-2):141-146.DOI:10.1159/000466530.
[2] Pathhamperuma C, Side R C. Fluorescensdequenching assay for aktiviteten af TEV-protease[J]. Analytical biochemistry, 2022, 659: 114954.