- Baggrund
Dataene opsummeret i denne rapport er udført af Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. for MycAwayTM Mycoplasma Real-time qPCR Detection Kit (2G) produkt.
Opsummeringsdata er kun til brugerens reference, og brugeren skal verificere mycoplasmametoden ved at bruge deres egne prøver for at bekræfte, at metoden kan opfylde brugerens krav. Alle laboratorier, der bruger dette sæt, anbefales at verificere følgende parametre: Detektionsgrænse, Specificitet og Robusthed.
Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. kan levere den detaljerede kvalifikationsrapport for dette sæt. Hvis brugeren bruger denne rapport, skal kun egnetheden (som inkluderede detektionsgrænse og specificitet) verificeres.
Validering indhold:
| Præstation | Valideringsparametre | Valideringsresultater |
| Detektionsgrænse | Mycoplasma Strain Detection Limit | Detektionsgrænse for 10 typer farmakopeiel mycoplasma: 10 CFU/mL, hver testet 24 gange med en detektionsrate på ≥95%. |
| Specificitet | Eksempel på matrixinterferens | Testede 9 forskellige prøvematricer og DNA-fortyndingsopløsninger, ingen mycoplasma påvist. |
| Krydsreaktivitet | Testede 14 stammer og 6 almindeligt anvendte ingeniørceller i biofarmaceutiske produkter, ingen mycoplasma påvist. | |
| Holdbarhed | Fryse-tø stabilitet | Kan modstå 20 gentagne fryse-tø-cyklusser uden at påvirke sættets ydeevne. |
| Termisk accelerationsstabilitet | Upåvirket under forhold på 37°C i 14 dage og 4°C i 30 dage. | |
| Instrumentkompatibilitet | Kompatibel med ABI7500, ABI QuantStudio™5, Bio-Rad CFX96 og Roche LightCycler®480. | |
| Dækning | Dækning af Mycoplasma DNA-typer | Databasesammenligning ved hjælp af mycoplasma 16S rRNA-sekvenser dækker 183 arter inden for klassen Mollicutes. |
- Eksperimentelle materialer og metoder
2.1 MycAwayTM Mycoplasma Real-time qPCR Detection Kit (2G), Leverandør: Yeasen, Kat.nr.: 40619ES60.
2.2 MolPureTM Magnetisk resterende DNA-prøveforberedelseskit, Leverandør: Yeasen, Kat.nr.: 18461ES60.
2.3 Mycoplasma-følsomhedsstandarderne er købt hos Minerva Biolabs (MB), hvis stammer er fra National Collection of Type Cultures (NCTC). Følsomhedsstandarderne er inaktiveret mycoplasma og bruges til den metodiske verifikation af nukleinsyreamplifikationsmetoden (qPCR/PCR-metoden) til mycoplasmadetektion. Der købes i alt 10 slags mycoplasmaer, som inkluderer kravene i EP 2.6.7 og JP G3. Oplysningerne om standarderne er som følger:
| Sælger | Kat nr. | NCTC nr. | ATCC Ingen. | Materiale navn |
| Minerva Biolabs (MB) | 102-1003 | 10129 | 23838 | 10 CFU™ Følsomhedsstandard Mycoplasma arginini |
| 102-2003 | 10112 | 23714 | 10 CFU™ Følsomhedsstandard Mycoplasma orale | |
| 102-3003 | 10115 | 19610 | 10 CFU™ Følsomhedsstandard Mycoplasma gallisepticum | |
| 102-4003 | 10119 | 15531 | 10 CFU™ Følsomhedsstandard Mycoplasma pneumoniae | |
| 102-5003 | 10124 | 25204 | 10 CFU™ Følsomhedsstandard Mycoplasma synoviae | |
| 102-6003 | 10117 | 19989 | 10 CFU™ Følsomhedsstandard Mycoplasma fermentans | |
| 102-7003 | 10130 | 17981 | 10 CFU™ Følsomhedsstandard Mycoplasma hyorhinis | |
| 102-8003 | 10116 | 23206 | 10 CFU™ Følsomhedsstandard Acholeplasma laidlawii | |
| 102-9003 | 10164 | 27556 | 10CFU™ Følsomhedsstandard Spiroplasma citri | |
| 102-11003 | 10113 | 23064 | 10 CFU™ Følsomhedsstandard Mycoplasma salivarium |
2.4 Originale data: den elektroniske version blev registreret i 'Eksperimentel rapport' underfilen til den overordnede fil 'MycAwayTM Mycoplasma Real-time qPCR Detection Kit (2G)'.
2.5 Metoder: Materialerne og operationsmetoderne, der blev brugt til eksperimentet, blev som udgangspunkt produceret eller indstillet af Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., som blev vurderet og verificeret i lang tid, udviklingen og fremstillingen af kittet er fulgt ISO 13485-systemet.
- Kvalifikationens indhold og resultater
3.1 Detektionsgrænse (LOD)
Nukleinsyreekstraktion såvel som påvisning af 10 CFU/mL Mycoplasma-standardstammen blev udført i overensstemmelse med instruktionerne for standardstammen samt instruktionerne for ekstraktions- og detektionskittet. Der blev opnået i alt 24 assays for 10 CFU/ml Mycoplasma-standardstammen. NCS (Negative Control Sample) og NTC (No Template Control) prøver blev testet samtidigt i hvert eksperiment.
Resultaterne viste, at NCS- og NTC-resultaterne var tilfredsstillende, og alle 24 10 CFU/mL prøver testede positive, hvilket opfylder kravet om at have mindst 23 positive resultater ud af 24 tests.
| Ingen. | Materiale navn | Koncentration af bakteriel væske |
| 1 | Mycoplasma arginini | 10 CFU/ml |
| 2 | Mycoplasma orale | 10 CFU/ml |
| 3 | Mycoplasma gallisepticum | 10 CFU/ml |
| 4 | Mycoplasma pneumoniae | 10 CFU/ml |
| 5 | Mycoplasma synoviae | 10 CFU/ml |
| 6 | Mycoplasma fermentans | 10 CFU/ml |
| 7 | Mycoplasma hyorhinis | 10 CFU/ml |
| 8 | Akoleplasma laidlawii | 10 CFU/ml |
| 9 | Spiroplasma citri | 10 CFU/ml |
| 10 | Mycoplasma salivarium | 10 CFU/ml |
Tabel 1 Oplysninger om validerede stammer
| 10 CFU/ml | Forsøg 1 | Forsøg 2 | Forsøg 3 |
| Detektionshastighed | 8/8 | 8/8 | 8/8 |
| Total | 24/24 | ||
Tabel 2 Detektionsgrænseresultater
3.2 Specificitet
3.2.1 Mycoplasma test rækkevidde
Primerprobesekvenserne i sættet blev sammenlignet med 16S rRNA-genomet i databasen. Gennem bioinformatik analyse blev det opnået, at MycAwayTM Mycoplasma qPCR-detektionskit (probemetode) af NextSense Biologicals kan dække mindst 183 arter af Zooxanthellae, herunder 120 Mycoplasma, 9 Ureaplasma, 33 Spiroplasma og 7 Cholestrongyla, og så videre.
3.2.2 Eksempel på matrixinterferens
9 substrater (Dulbecco's MEM, Ham's F-10 Medium, M-199 Medium, Skinke's F-12K Kaighn's, RPMI-1640 Medium, McCoy's 5A, Skinke's F-12K Kaighn's+1.0mM/L Glutamin, L-15 MDLE.05 mM L-Glutamin, DMEM-low glucose Standard Medium) bruges som prøver til at verificere prøvematrixinterferensen, resultaterne viste, at mediet ikke har nogen interferens med kit-reagenserne.
3.2.3 Flexibacteria detektionsområde
Ekstraktion og påvisning af inaktiveret mycoplasma (Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hyorhinis, Acholeplasma laidlawii, Spiroplasma citri, Mycoplasma citri og Mycoplasma citri, Mycoplasma citri og Mycoplasma citri, CFU/CS1) NTC prøvetest.
Resultaterne viste, at NCS og NTC ikke blev opdaget, og resultaterne var negative; alle 10 mycoplasmaarter blev påvist, og resultaterne var positive.
3.2.4 Krydsreaktion
For 14 ikke-flexibakterielle stammer, herunder Clostridium (Clostridium perfringens, Clostridium acetobutylicum), Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus), Streptococcus (Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae), en række andre almindelige bacillus-coccus-bakterier (Stfungimidis-mikroorganisme, epigimidis, Acinetobacter baumannii, Enterobacter aerogenes, Micrococcus garciniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonalbacterium leucocephala, Salmonella enterica enteritidis subsp (HEK293, 293T, Vero, CHO, E.coli, SF9) blev brugt til mycoplasma-detektion ved hjælp af MolPureTM Magnetisk perlemetode til rest-DNA-prøveforbehandlingskit (flasker) og MycAwayTM Mycoplasma qPCR Detection Kit (Probe Method) (2G), og hvert eksperiment blev udført samtidigt med PCS, NCS og NTC prøvetestning.
Resultaterne viste, at PCS-, NCS- og NTC-resultaterne var tilfredsstillende; testprøverne var negative, og der forekom ingen krydsreaktivitet.
3.3 Robusthed
3.3.1 Fryse-tø stabilitet
Mycoplasma testkittet blev udsat for fryse-optøningseksperimenter under betingelserne -25℃~-15℃, og resultaterne viste, at kittet var i stand til at modstå 20 gange gentagen frysning og optøning, og dets ydeevne blev ikke påvirket.
3.3.2 Accelereret stabilitet
Mycoplasma-detektionssættet blev varmeaccelereret ved 37 ℃ i henholdsvis 14 dage og ved 4 ℃ i 30 dage, og resultaterne viste, at produktets ydeevne ikke blev påvirket.
3.3.3 Instrumentets anvendelighed
Til mycoplasma-detektionskittet blev forskellige koncentrationer af positiv kontrol og Mycoplasma pneumoniae DNA i kittet brugt som prøver, der skulle testes, og eksperimenterne blev udført på fire forskellige mærker og modeller, nemlig Thermo Scientific ABI7500, Thermo Scientific ABI Q5, Shanghai Hongshi SLAN-96S, og Roche0 LightCycler respektivt.Eksperimenterne blev udført på qPCR-instrumenter fra fire forskellige mærker og modeller, Shanghai Hongshi SLAN-96S og Roche LightCycler®480.
Resultaterne viste, at prøverne, der skulle testes, blev detekteret på qPCR-instrumenter af forskellige producenters modeller, og de negative kontrolresultater var kvalificerede, og sættets ydeevne blev ikke påvirket.
- 4.Reference
4.1 Mycoplasma undersøgelsesmetode <3301>. Kinesisk farmakopé, del III [S]. Beijing: China Science and Technology Press, 2020: 542-543.
4.2 Retningslinjer for validering af analysemetoder <9101>. Kinesisk farmakopé, del III [S]. Beijing: China Science and Technology Press, 2020: 682.
4.3 Retningslinjer for validering af alternative metoder til mikrobiologisk testning af lægemidler <9201>. Kinesisk farmakopé, del III [S]. Beijing: China Science and Technology Press, 2020: 684.
4.4 Mycoplasmas. Europæiske Farmakopé[S]. 10. udgave, 2020: Afsnit 2.6.7, 194-199.
4.5 Mycoplasmatestning for cellesubstrater, der anvendes til produktion af bioteknologiske/biologiske produkter <G3-14-170>. Den japanske farmakopé[S]. 18. udgave, 2021: 2678-2682.
4.6 Erica J. Fratz-Berilla, Phillip Angart, Ryan J. Graham, et al. Indvirkning på produktkvalitetsegenskaber af monoklonale antistoffer produceret i CHO-cellebioreaktorkulturer under tilsigtede mycoplasma-kontaminationshændelser. Bioteknologi og bioteknik. 2020;117(9): 2802-2815.
4.7 Dmitriy V. Volokhov, Laurie J Graham, Kurt A Brorson, Vladimir E Chizhikov. Mycoplasmatest af cellesubstrater og biologiske stoffer: Gennemgang af alternative ikke-mikrobiologiske teknikker. Mol celleprober. 2011 apr-jun;25(2-3):69-77.
4.8 AL Ingebritson, CP Gibbs, C. Tong, GB Srinivas. En PCR-detektionsmetode til test af Mycoplasma-kontamination af veterinærvacciner og biologiske produkter. Indlæs anvendt mikrobiologi. 2015 feb;60(2):174-180.
Bestillingsoplysninger
| Beskrivelse | Varenummer |
| 18461ES | |
| MycAway™ Mycoplasma qPCR-detektionskit (2G) | 40619ES |