Oversigt
Rest-DNA fra værtsceller er en procesrelateret urenhed, der er involveret i produktionen af biologiske lægemidler, som ikke kun reducerer effektiviteten af biologiske lægemidler, men også kan udgøre sikkerhedsproblemer såsom infektiøsitet eller tumorfremkaldende virkning. Derfor har tilsynsmyndigheder i forskellige lande pålagt grænser for mængden af resterende DNA i biologiske lægemidler.
Nuværende WHO- og FDA-retningslinjer anbefaler rest-DNA i færdige produkter på højst 10 ng/dosis, og FDA angiver også, at rest-DNA i værtscelle-DNA fra biologiske lægemidler ikke bør være mere end 100 pg/dosis. De generelle principper for den europæiske farmakopé fastslår, at de fleste rest-DNA-grænser for biologiske produkter ikke bør være mere end 10 ng/dosis, men rest-DNA-grænserne for individuelle vacciner er strengere, f.eks. bør rest-DNA i den inaktiverede vaccine mod hepatitis A ikke være mere end 100 pg/dosis i vaccinen mod B10, og at rest-DNA ikke bør være mere end patitis B1. pg/dosis. 2020-udgaven af den kinesiske farmakopé, del III, foreskriver, at DNA-resten i biologiske præparater produceret på en cellulær matrix ikke må overstige 100 pg/dosis, og DNA-resten i vacciner produceret på en bakterie- eller svampematrix må ikke overstige 10 ng/dosis.
Derudover giver nationale farmakopéer også vejledende anbefalinger for metoderne til bestemmelse af eksogene DNA-rester. 2017-udgaven af USP40-NF35 General Provision 1130 i US Pharmacopoeia beskriver 3 metoder til bestemmelse af eksogene DNA-rester, som er DNA-probe-hybridisering, tærskelmetode og real-time kvantitativ PCR-metode. Den Europæiske Farmakopé foreslår kvantitativ PCR i realtid og immunenzymatiske metoder, som er 2 følsomme analysemetoder til kvantificering af resterende DNA i værtsceller. Den kinesiske farmakopé 2020-version af de tre generelle regler 3407 bestemmer også, at værtscelle-DNA-restdetektionsmetoderne er DNA-probehybridisering, fluorescensfarvning og kvantitativ PCR.
Blandt dem har qPCR-metoden meget høj sensitivitet, sekvensspecificitet og nøjagtighed, som kan give et pålideligt detektionsmiddel til den biofarmaceutiske industri i procesforskning og kvalitetskontrol af færdige produkter, og er nu blevet den foretrukne detektionsmetode for hver biologisk produktproducent.
Yeasen Bioteknologi Resterende DNA-detektionssæt
Baseret på princippet om fluorescerende probe qPCR har Yeasen udviklet en række hurtige og specialiserede værtscelle-rest-DNA-detektionskit, herunder CHO, HEK293, E.coli, Vero, Human, MDCK, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris og så videre. Disse kits giver specialiseret og hurtig detektion af DNA-rester i mellem-, halvfabrikata og færdige produkter under udvikling og produktion af biologiske lægemidler såsom antistoflægemidler, celle- og genterapiprodukter, rekombinante proteinlægemidler og vacciner.
Feature
Høj følsomhed: udviklet baseret på fluorescerende probe qPCR-metode med LLOD så lavt som 0.05fg/µL;
Høj nøjagtighed: genvinding af prøvespikning i intervallet 70%~130%;
Høj specificitet: ingen krydsreaktivitet med irrelevant DNA, hvilket reducerer falske positiver ved påvisning;
Overholdelse af regler: fuldt valideret i overensstemmelse med Chp, USP, ICHQ2(R1) og andre krav, ydeevne i overensstemmelse med kinesiske og udenlandske regulatoriske standarder;
Samarbejde med revision: Produktproduktion er i overensstemmelse med ISO13485 kvalitetssystemstandarder med perfekte revisionsdokumenter.
Kvalitetsgaranti: Råmaterialerne i kittene er alle uafhængigt udviklet, og qPCR Mix og andre enzymprodukter produceres på en ultra-ren enzymfabrik.
Anvendelse
AntistoflægemidlerHost-celle-resterende urenhedsdetektionVacciner Detektion af resterende urenheder i værtsceller
Rekombinante proteinlægemidler Detektion af restceller af værtsceller
Specifikation
| Test og valideringsprogram | Referencestandarder eller krav | Nnote | |
| 1. Sætstandarder (referencestandarder) | Benchmarking til nationale standarder eller Udarbejdede standarder |
| |
| 2. Linear Range | Standardkurvens omfang | Se manualen eller den faktiske situation (f.eks. 30fg/μL~300pg/μL) |
|
| R2 | ≥0,98 (PsYeasen Kits≥0,99） | Krav til HCD i Chinese Pharmacopoeia 2020 Edition 3407 Generelle bestemmelser | |
| Hældning | -3,1~-3,8 (PsYeasen-sæt -3.1~-3.6） | Krav til HCD i Chinese Pharmacopoeia 2020 Edition 3407 Generelle bestemmelser | |
| Forstærkningseffektivitet | 90%~110%（（PsTilsvarende hældning -3.1~-3.6, Krav inden for industrien） |
| |
| 3. ENnøjagtighed | Afvigelse fra national standard DNA | ＜15 % |
|
| Prøve spiking genvindingshastighed | 50% ~ 150% (Krav inden for branchen 70~130 %) | Krav til HCD i Chinese Pharmacopoeia 2020 Edition 3407 Generelle bestemmelser | |
| 4. Precision | Gentagelig | CV ＜15 % |
|
| Mellempræcision | CV ＜15 % |
| |
| 5. Ssæregenhed | Ingen interferens med eksogent DNA |
| |
| 6. Lefterligning af kvantificering | fg/μL niveau |
| |
| 7. Sbordet | Gentagen frysning og optøning | 10 gange |
|
| Accelerationsstabilitet | 2~8℃ 30 dage, 37℃ 14 dage |
| |
| Gyldighedsperiode | -20°C opbevaring i 2 år |
| |
Figurer
Høj følsomhed: LLOQ så lav som 0,3 fg/µL, LLOD så lav som 0,05 fg/µL.
1. Det lineære område af CHO-værtscelle-residual-DNA-detektionskit (3G) var 3fg/μL~300pg/μL, R2=1, amplifikationseffektiviteten var 99,29%, og CV'et for detektionsværdien for hver koncentration var <15%.
Figur 1. CHO DNA (3G) kalibreringsgraf (venstre) og lineær kortlægning af amplifikationskurven (højre)
2. Detekter CHO DNA (3G) ved det laveste koncentrationspunkt af den standardiserede sang ved 3fg/uL og under koncentrationer, 10 replikater pr. koncentration. Resultaterne viste, at ved koncentrationer på 0,3 fg/uL og derover var CV <20 %, dvs. grænsen for kvantificering af CHO Host Cell DNA Residue Assay Kit (3G) var 0,3 fg/uL.
Figur 3. 0,05fg/μL CHO DNA (3G) qPCR-analyseresultater
Høj specificitet: ingen krydsreaktivitet med andet værtscelle-DNA.
Ved at vurdere interferensen af genomisk DNA fra musearter med høj affinitet til CHO DNA (3G) såvel som genomisk DNA fra celler, der almindeligvis anvendes i produktionen af biologiske lægemidler til CHO DNA-detektionsreagenset, overlappede amplifikationskurverne for interferensgruppen og kontrolgruppen, og der blev ikke set nogen interferens (følgende grafer viser, i rækkefølge, interferensdataene for Moliuse, HEK2, genomisk og EEK29. CHO DNA-detektionsreagens).
Figur. 4.Resultater af interferenseksperimenter med CHO DNA (3G) kit
Produktinformation
| Kategorisering | Varenr | Produktnavn | Specifikation |
| Prøveforbehandling | 18461ES | 25T/100T | |
| 18467ES | MolPure® Mag48 prøveforberedelseskit FN | 3×16T/6×16T | |
| Nukleinsyreekstraktionsinstrument | 80511ES | 48-kanals automatiseret nukleinsyreekstraktor | 48 Fluxer |
| Resterende DNA-påvisning | 41307ES | 50T/100T | |
| 41308ES | 50T/100T | ||
| 41310ES | SV40LTA&E1A Residue DNA Detection Kit | 50T/100T | |
| 41317ES | Hansenula polymorpha Værtscelle DNA-restdetektionskit | 50T/100T | |
| 41319ES | MDCK værtscelle-dna-restdetektionskit | 50T/100T | |
| 41323ES | Plasmid DNA-restdetektionskit | 50T/100T | |
| 41324ES | S. cerevisiae Værtscelle DNA-restdetektionskit | 50T/100T | |
| 41325ES | Human Host Cell DNA Residue Detection Kit | 50T/100T | |
| 41328ES | Pichia pastoris Værtscelle DNA-restdetektionskit | 50T/100T | |
| 41330ES | Sf9 og Baculovirus DNA-restdetektionskit | 50T/100T | |
| 41331ES | 50T/100T | ||
| 41332ES | 50T/100T |