Isoterm amplifikationsteknologi kan opnå formålet med at amplificere specifikke nukleinsyresekvenser under konstante temperaturforhold. På grund af egenskaberne ved intet specielt udstyr, kort forstærkningstid og høj følsomhed, har det vist gode anvendelsesmuligheder i on-site detektion og point-of-care diagnose og er meget velegnet til udvikling af molekylære diagnostiske værktøjer.

I forbindelse med den nye coronavirus-pandemi med stigende stammer og infektivitet, kan isotermisk amplifikationsteknologi detektere den nye coronavirus hurtigt med enkle instrumenter, der hjælper med at løse problemet med, at nogle COVID-19-patienter ikke hurtigt kan bekræftes på grund af den lange detektionstid og høje krav til detektionsudstyr og reagenser af traditionelle PCR-teknikker. Så hvad er princippet i RT-LAMP, en af ​​de isotermiske amplifikationsteknikker? Hvad er de højkvalitetsråvarer, som Yeasen kan levere?

1. Hvad er princippet for RT-LAMP?
2. Primer design til RT-LAMPE
3. Hvilke råvarer kan Yeasen levere?
4. Produktvalgsguide

1. Hvad er princippet for RT-LAMP?

I 2000 etablerede japanske forskere Notomi og andre en ny nukleinsyreamplifikationsteknologi kaldet loop-medieret isotermisk amplifikation (LAMP). LAMP bruger 4 specifikke primere designet til 6 regioner af målgenet og bruger strengforskydnings-DNA-polymerase til at amplificere 109 kopier af målsekvensen på ti minutter under isotermiske forhold (60~65 ℃). Resultaterne blev bedømt ved agarosegelelektroforese, og de positive resultater viste stigeformede bånd. LAMPE har karakteristika af stærk specificitet, høj følsomhed, hurtig og enkel betjening og lave omkostninger. Med den kontinuerlige forbedring og perfektion af denne teknologi bruges den i øjeblikket til påvisning af forskellige patogene mikroorganismer.

RT-LAMP er en metode, hvor revers transkriptase tilsættes til LAMP-amplifikationssystemet, som kan realisere den direkte påvisning af viralt RNA. Amplifikationseffektiviteten af ​​LAMP er ekstrem høj, så en stor mængde nukleinsyre kan amplificeres med kun en lille mængde cDNA. Tiden for revers transkription i nukleinsyreamplifikationsprocessen gemmes, og detektionshastigheden af ​​RNA accelereres.

DNA er i en tilstand af dynamisk ligevægt ved omkring 65 ℃. Under påvirkning af strengforskydnings-DNA-polymerase, startende fra 3'-enden af ​​F2-segmentet af FIP-primeren, parres den med den komplementære sekvens af template-DNA'et for at initiere strengforskydnings-DNA-syntese. F3-primeren er komplementær til F3c i den forreste ende af F2c og tager 3'-enden som udgangspunkt for at syntetisere dens DNA, mens den erstatter DNA-strengen syntetiseret af den førende FIP-primer med virkningen af ​​en strengforskydnings-DNA-polymerase. Forlæng fremad. DNA-strengen syntetiseret af den endelige F3-primer danner en dobbeltstreng med en template-DNA-streng. DNA-strengen syntetiseret af FIP-primeren erstattes af F3-primerstrengen for at generere en enkelt streng. Denne enkeltstreng har komplementære F1c- og F1-segmenter ved 5'-enden, så selvbaseparring udføres for at danne en cirkulær struktur. Og BIP-primeren hybridiseres og kombineres med enkeltstrengen, og 3'-enden af ​​BIP-primeren bruges som udgangspunkt for at syntetisere en komplementær streng, og strukturen åbnes i processen.Derefter indsættes primere svarende til F3 og B3 fra BIP-primeren, basekomplementær parring udføres, og en ny komplementær streng syntetiseres fra 3'-enden som udgangspunkt. Der er komplementære sekvenser i begge ender af det erstattede enkeltstrengede DNA, og selvbaseparring sker for at danne en cirkulær struktur, så hele kæden præsenterer en håndvægtlignende struktur. Denne struktur er startstrukturen for amplifikationscyklussen af ​​RT-LAMP-metoden.

I den håndvægtformede struktur udføres DNA-forlængelsen ved at bruge F1-segmentet i 3'-enden som udgangspunkt og med sig selv som skabelon. Og FIP-primeren F2 hybridiserer med den enkeltstrengede F2c på løkken for at starte en ny runde af strengforskydningsreaktion. Den dobbeltstrengede nukleinsyre syntetiseret fra F1-segmentet dissocieres, og på samme måde dannes en cirkulær struktur på nukleinsyren. Der er en enkeltstrenget form af B2c på den cirkulære struktur, og B2 på BIP-primeren hybridiserer med den for at initiere en ny runde amplifikation, og en cirkulær struktur dannes gennem den samme proces. Ifølge denne proces cykler komplementære sekvenser på den samme streng gennem parring, strengforlængelse og danner til sidst strukturer af forskellig størrelse.

2. Primer design til RT-LAMPE

Primerdesign er nøglen til vellykket amplifikation og detektion af RT-LAMP. RT-LAMP primere omfatter to ydre primere (F3 og B3) og to indre primere (FIP og BIP). F3-primer: Den opstrøms ydre primer, bestående af F3-regionen, er komplementær til F3c-regionen af ​​målgenet. FIP-primer: opstrøms intern primer, bestående af F2-regionen, F2c-regionen i 3'-enden af ​​målgenet i F2-regionen er komplementær til F1c-regionen i 5'-enden af ​​målgenet. BIP-primer: nedstrøms intern primer, sammensat af B2-region, B2-region er komplementær til B2c-regionen i 3'-enden af ​​målgenet og har samme sekvens som B1c-regionen i 5'-enden af ​​målgenet.

I lighed med PCR bør primerdesignprincipper være opmærksomme på faktorer som basesammensætning, GC-indhold og understruktur. Derudover skal følgende punkter bemærkes. 5'-endedelene af de indre primere FIP og BIP, dvs. F1c og B1c, er generelt 8-50 bp lange. Længden er fortrinsvis 15 til 25 bp, og Tm-værdien er større end Tm-værdierne for F2 og B2 ved 3'-endedelen. 3'-endedelene af de indre primere FIP og BIP, dvs. F2 og B2, er generelt 8-50 bp lange. Længden er fortrinsvis 15-25 bp, og Tm-værdien er i overensstemmelse med den optimale temperatur af Bst-DNA-polymerasen valgt i eksperimentet. Længderne af de ydre primere F3 og B3 er generelt 8-50 bp. Længden er fortrinsvis 15-25 bp, og dens Tm-værdi er mindre end værdien for F2 og B2. Når der designes primere, bør løkkestrukturen og størrelsen af ​​målsekvensen tages i betragtning. Når antallet af baser i løkken er større end 40 bp, og målsekvensens størrelse er 130-200 bp, er amplifikationseffektiviteten den højeste.

3. Hvilke råvarer kan Yeasen levere?

3.1 [Ny opgradering] Yeasen Bst Plus DNA polymerase

Den nyopgraderede Hieff™ Bst Plus DNA-polymerase (Kat #14402ES, 14403ES) opnås ved at udtrykke og oprense DNA-polymerasegenet fra Bacillus stearothermophilus sp mangler 5′→3′ exonukleasedomænet i E.coli.Enzymstrengsforskydningsevnen er stærk og har fordelene ved høj følsomhed, høj amplifikationseffektivitet og høj dUTP-tolerance og kan i vid udstrækning anvendes i realtidsdetektion af patogener baseret på isotermisk amplifikationsteknologi.

3.1.1 Hurtig og høj følsomhed

Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA-polymerase har høj følsomhed og kan detektere målgenet så lavt som 5 kopier. Mængden af ​​skabelon er på femtogram (fg) niveau, og amplifikationshastigheden er hurtigere end konkurrerende produkter.

Figur 1. RT-LAMP-reaktion blev udført med Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA-polymerase (orange) og Bst-enzymer fra konkurrent N (grå) og konkurrent T (blå) for at amplificere SARS-CoV-2. Resultaterne viser, at Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA-polymerase altid kan nå tærsklen hurtigere end konkurrerende produkter, og amplifikationshastigheden er hurtigere.

4. Produktvalgsguide

Produkterne leveret af Yeasen er som følger:

Tabel 1.Produktinformation