dNTP står for mønstret ribonukleotidtriphosphat brugt i PCR, der er i stand til at amplificere en voksende DNA-streng. Med andre ord, dNTP'er i PCR hjem med komplementære DNA-strenge gennem hydrogenbindinger, og de voksende DNA-strenge udvides ved hjælp af Taq DNA-polymerase. Hvad er den specifikke anvendelse af dNTP i PCR? Hvilke egenskaber skal dNTP'er med høj renhed have?

1. Hvad er dNTP'er?
2. Hvad er koncentrationen af ​​dNTP i PCR?
3. Hvad er de påkrævede egenskaber ved High purity dNTP?
4. Relaterede produkter og ydeevne

1. Hvad er dNTP'er?

Deoxynukleosidtrifosfater (dNTP'er) er nukleosidtrifosfater indeholdende deoxyribose, en kæde af nukleotider bestående af ribose, en base og en fosfat. dNTP'er er de essentielle byggesten i nukleinsyremolekyler, og er som sådan nødvendige komponenter i PCR-blandinger, da intet nyt amplificeret DNA kunne genereres uden dem. De fire individuelle deoxynukleotider, som udgør en DNA-sekvens, herunder deoxyadenosintriphosphat (dATP), deoxythymidintriphosphat (dTTP), deoxycytidintrifosfat (dCTP) og deoxyguanosintriphosphat (dGTP). Derudover er kvaliteten af ​​dNTP'er også afgørende for succesen af ​​mange procedurer, såsom PCR, cDNA-syntese, qPCR, sekventering, kloning og DNA-mærkning.

Der er fire typer af dNTP eller deoxynukleotidtriphosphat, hvor hver især bruger en forskellig DNA-base: adenin (dATP), cytosin (dCTP), guanin (dGTP) og thymin (dTTP). Brug af dNTP i forlængelsesfasen giver enkeltbaser klar til at gå ind i DNA og fordoble det, som byggesten. Da formålet med teknikken er at syntetisere nyt DNA, giver dNTP nukleotider til den "udpakkede" streng ved hjælp af skabelonen på en enkelt side. Dette forvandler en enkelt DNA-streng til to og kan fortsætte eksponentielt, så længe reagenserne forbliver til stede indtil det sidste hold-stadium.

2. Hvad er koncentrationen af ​​dNTP i PCR?

PCR er en in vitro-teknik til DNA-syntese, der udføres for at generere flere kopier af et DNA-fragment af interesse, så det kan visualiseres under gelelektroforese. Formålet med PCR er at lave et stort antal kopier af DNA til forskellige downstream-applikationer i DNA-sekventering eller DNA-mikroarrays. Dets komponenter omfatter DNA-skabeloner, primere, buffere og Taq DNA-polymerase dNTP. For at forstå mekanismen for PCR er det nødvendigt at forstå vigtigheden og princippet for de anvendte komponenter. dNTP er en af ​​nøglekomponenterne i PCR. Funktionen af ​​dNTP'er i PCR er at amplificere den voksende DNA-streng ved hjælp af Taq DNA-polymerase og at kombinere med den komplementære DNA-streng gennem hydrogenbinding.

Processen med PCR er opdelt i tre temperaturafhængige trin: denaturering, annealing og forlængelse. Under denatureringstrinnet denatureres dobbeltstrenget DNA til enkeltstrenget DNA. Under annealingstrinnet binder primerne på den nøjagtige placering af deres komplementære sekvens, og under forlængelsestrinnet tilføjer Taq DNA-polymerase dNTP'er til den voksende DNA-streng. Når strengene er åbnet, og primerne binder til det enkeltstrengede DNA, begynder Taq DNA-polymerase sin katalytiske aktivitet. I næste trin starter tilføjelsen af ​​dNTP'er, som binder til P-DNA-komplekset med mindre affinitet, hvis det nøjagtige komplementære nukleotid er til stede. Kort efter at Taq DNA-polymerase holder, forekommer hydrogenbindingsinteraktioner mellem komplementære baser og dNTP'er. Her er det ikke hele nukleotidet i starten, men basen (nitrogenbasen) på dNTP'en, der bestemmer om der skal bindes eller ej.For det første, hvis den finder en komplementær base (A for T, G for C) på skabelonen ssDNA, vil den danne en hydrogenbinding mellem dem. Der dannes tre hydrogenbindinger mellem C og G og to hydrogenbindinger mellem A og T. Når først hydrogenbindingen er dannet, overholder Taq DNA-polymerase inkorporeringen af ​​dNTP i den voksende DNA-streng ved at danne en phosphodiesterbinding. Nu efter phosphodiesterbindingen er dannet, går Taq DNA-polymerase et skridt videre med at tilføje nye dNTP'er. En phosphodiesterbinding dannes mellem 3'OH af primeren og 5'P af dNTP. Efter hydrogenbinding katalyserer Taq DNA-polymerase reaktionen ved at fjerne gamma- og beta-phosphater fra triphosphaterne af dNTP'er. Efter at reaktionen er afsluttet, frigives to pyrophosphater (PPi). Men den nøjagtige kinetik af dNTP'er og Taq-polymerase-interaktion i PCR-reaktioner forbliver ukendt.

Disse fire nukleotider tilsættes typisk til PCR-reaktionen i ækvimolære mængder for optimal baseinkorporering. Men i visse situationer, såsom tilfældig mutagenese ved PCR, tilføres ubalancerede dNTP-koncentrationer med vilje for at fremme en højere grad af fejlinkorporering af en ikke-korrekturlæsende DNA-polymerase. Den faktor, der bestemmer den minimale dNTP-koncentration, er DNA-længden og sammensætningen af ​​målsekvensen. I PCR-reaktionen er dNTP generelt 50-200 μmol/L. Når den endelige dNTP-koncentration er større end 50 mmol/L, kan det hæmme aktiviteten af ​​Taq DNA-polymerase. Koncentrationerne af de fire dNTP'er bør være ens for at reducere fejlinkorporering under amplifikation på grund af mangel på én dNTP.

I almindelige PCR-applikationer er den anbefalede slutkoncentration af hver dNTP normalt 0,2 mM. Højere koncentrationer kan være nyttige i nogle tilfælde, især ved tilstedeværelse af høje koncentrationer af Mg²⁺, som Mg²⁺ binder til dNTP'er og reducerer deres inkorporeringshastighed, hvilket øger den ikke-specifikke hastighed. dNTP indeholder fosfat, som kan kombineres med Mg²⁺ for at reducere koncentrationen af ​​frit Mg²⁺, så ændringen i dens koncentration vil påvirke den effektive koncentration af Mg²⁺. Under højkoncentrations-DNA- og dNTP-betingelser vil Mg²⁺ koncentrationen skal justeres i overensstemmelse hermed. Også knapheden på dNTP'er fører til ufuldstændige PCR-produkter. Dog kan dNTP'er, der overstiger optimale koncentrationer, hæmme PCR. For effektiv inkorporering af DNA-polymerase bør frie dNTP'er være til stede i reaktionen i en koncentration på ikke mindre end 0,01-0,015 mM.

3. Hvad er de påkrævede egenskaber ved High purity dNTP?

Siden dens opdagelse er polymerasekædereaktionen det uovertrufne værktøj, der bruges i molekylær genetisk forskning. dNTP anvendes i PCR til at udvide den voksende DNA-streng. Selvom kvaliteten af ​​dNTP i systemet er dårlig, vil det have en negativ indvirkning på det endelige produkts egenskaber. Yeasens dNTP med høj renhed er velegnet til alle former for meget følsomme og reproducerbare DNA-synteseapplikationer.

Yeasen tilbyder brugsklare GMP-grade nukleotider, sæt og blandinger, leveret som natriumsalte i renset vand ved pH 7,0. Fremstillingsprocessen eliminerer urenheder og PCR-specifikke inhibitorer, og dNTP'erne er specielt fremstillet til molekylærbiologiske anvendelser. dNTP'erne oprenses med præparativ HPLC og har mindst 99% renhed. De kan bruges i PCR, RT-qPCR, LAMP, DNA-mærkning og DNA-sekventeringsprocesser.
Strenge kontrolstandarder og state-of-the-art teknologi sikrer den bedste kvalitet af produktet. Hvert parti af dNTP testes for forskellige rester (bakterielt DNA, humant DNA, DNase, RNase, endonuklease).Produktet er stabilt fra batch til batch og velegnet til alle former for meget følsomme og reproducerbare DNA-synteseapplikationer.

4. Relaterede produkter og ydeevne

4.1 Ingen bakteriel DNA-rester

Figur 1. Detektionsresultaterne viser, at dNTP'erne ikke har nogen bakterielle genomrester.

4.2 Ingen human DNA-rest

Figur 2. Detektionsresultaterne viser, at dNTP'er ikke har nogen humane genomrester.

4.3 Ingen DNase-, RNase- og Endonuklease-kontamination

Figur 3. Detektionsresultaterne viser, at dNTP'er ikke har nogen DNase, RNase og endonuklease.

4.4 PCR-amplifikation (20 kb DNA)

Figur 4. PCR-amplifikationsresultatet er det forventede 20 kb-produkt.

4.5 Produktoplysninger

Produkterne leveret af Yeasen er som følger.

Tabel 1.Produktinformation