Med den hurtige udvikling af bioteknologi har mRNA-terapi, som en ny behandlingsmetode, tiltrukket sig stor opmærksomhed på grund af dens stærke programmerbarhed og hurtige responshastighed. Inden for mRNA-vacciner og genterapi er effektiv syntetisering af mRNA af høj kvalitet et nøgletrin i at nå terapeutiske mål. Under denne proces spiller T7 RNA-polymerase (T7 RNAP) en væsentlig rolle, den kan effektivt katalysere in vitro-syntesen af mRNA.
Selvom T7 RNAP spiller en afgørende rolle i mRNA-syntese, producerer det ofte dobbeltstrenget RNA (dsRNA) som et biprodukt i praksis. dsRNA er et af kendetegnene for mange vira, og derfor genkendes det let af intracellulære dsRNA-bindende proteiner, hvilket udløser medfødte immunresponser og inflammatoriske reaktioner. Dette betyder, at hvis mRNA-formuleringer indeholder et højere niveau af dsRNA, kan det føre til unødvendig immunaktivering, hvilket kan påvirke den terapeutiske effektivitet eller forårsage alvorlige bivirkninger. Overdreven dsRNA kan også interferere med den normale funktion af mRNA, herunder translationseffektivitet og mRNA-stabilitet, hvilket indirekte påvirker effektiviteten af mRNA-terapi.
Figur 1: Virkningen af dsRNA-biprodukter og den optimerede T7 RNAP-reaktion.
Derfor er udvikling og anvendelse af effektive metoder til at reducere dannelsen af dsRNA en afgørende del af udviklingen af mRNA-teknologi. Forskere har udviklet forskellige strategier, herunder brugen af forbedrede T7 RNA-polymeraser, modifikationsnukleotider, optimering af IVT-transkriptionsbuffere og nedstrøms oprensningsprocesser. Yeasen Biology udnytter mulighederne i sin ZymeEditor-styrede evolution-platform til løbende at udvikle kerneenzymråmaterialet til mRNA in vitro-syntese - T7 RNA-polymerase. Vi har udviklet en lav dsRNA T7 RNA-polymerase, der undertrykker RDRP-aktiviteten af T7 RNA-polymerase, hvilket fundamentalt reducerer dannelsen af dsRNA og derved sænker indholdet af dsRNA markant.
Produktdata
Udbytte: over 9 mg/ml
dsRNA-indhold: indholdet af dsRNA er blevet væsentligt reduceret med mindst 10 gange
Afdækningseffektivitet: over 99 %
Lav dsRNA T7 RNA polymerase Screeningsproces:
1) konstruktionen af et tilfældigt bibliotek og FADS high-throughput screeningsmetode, et tilfældigt mutationsbibliotek på over 10^6 blev screenet.
2) semi-rationelt design og mikropladeteknologi blev brugt til at screene et stedmættet bibliotek. Begge metoder gav lav dsRNA T7 RNA polymerase mutanter. Overvejelse af dsRNA-indholdet, samtidig med at det sikres, at andre indikatorer ikke reduceres (såsom integritet/afdækningseffektivitet/udbytte osv.), flere mutanter blev udvalgt, og en ved navn CleaScrip™ T7 blev brugt til kommerciel anvendelse.
Produktdata
I anvendelsesscenarier med forskellig længde har lav dsRNA T7 RNA-polymerase vist et meget signifikant fald sammenlignet med både WT T7 og konkurrerende produkter, samtidig med at det sikres, at udbytte og integritet ikke reduceres.
| Fragmentlængde | T7 RNA pol | Udbytte(mg/ml） |
Integritet(%） | dsRNA-indhold (ng dsRNA produceret pr. 1 ug RNA) |
| 4K | T7-WT | 12.4 | 88,3 | 0,4273 |
| CleaScrip™ T7 | 12.1 | 89,9 | 0,0129 | |
| Firma A | 11,0 | 87,8 | 0,0323 | |
| 9K | T7-WT | 9.5 | 81,9 | 2,9180 |
| CleaScrip™ T7 | 9,0 | 82,0 | 0,0379 | |
| Firma A | 7.2 | 78,7 | 0,1805 |
Bruger en cap-koncentration på 2,5 mM, kan fremragende afdækningseffektivitet stadig opnås på tværs af forskellige fragmentlængder sammenlignet med WT. Derudover observeres overlegen proteinekspressionsydelse også på cellulært niveau.
| Cap analog indgang（mM） | Afdækningseffektivitet (capping effektivitet)%）4K | |
| WT | Lavt dsRNA | |
| 10 | 100 | 100 |
| 5 | 100 | 100 |
| 2.5 | 100 | 100 |
Der er indgivet patent i USA.
Produktinformation
| Produktnavn | Katalognummer | Specifikation | Bind |
| CleascripTM T7 RNA polymerase (lavt dsRNA, 250 U/μL) | 10628ES | 100 /2500 /25.000KU | 400 μL/10 mL/100 mL |
| CleascripTM T7 RNA-polymerase GMP-kvalitet (lavt dsRNA, 250 U/μL) | 10629ES | 100 /2500 /25.000KU | 400 μL/10 mL/100 mL |