Figur 1: In vitro RNA-transkriptionsproces

Produktfordele

Højt udbytte: kan producere op til 200 μg på 2 timer gennem transkriptionsreaktion

Bedre alsidighed: egnet til transkription af 20nt-10000nt RNA

Fremragende præstation: reducerer effektivt biprodukterne fra transkription under IVT-processen

Flere applikationer: kan bruges til almindelig, mærket og modificeret RNA-syntese

Produktegenskaber

Figur 2: Udbytte af transskriptioner af forskellig længde

Figur 3: Kvalitet af transskriptioner af forskellig længde

Figur 4: Udtryk af transskriberet mRNA i HEK-293 celler

Bemærk: mRNA'et er blevet lukket med Vaccinia Capping Enzyme (Yeasen#10614/10615).

Eksperimentelle metoder

Optøningsreagenser

Centrifuger T7 RNA Polymerase Mix kort og anbring det på is. Optø 10× transkriptionsbuffer og ribonukleotids (ATP, CTP, GTP, UTP), bland og centrifuger til bunden af ​​røret, anbring 10 x transkriptionsbuffer ved stuetemperatur og anbring 4 typer ribonukleotider på is.

B.Samling af transkriptionsreaktion ved stuetemperatur

Forbered reaktionssystemet i henhold til følgende system:

Komponenter	Volumen (µL)	Slutkoncentration
RNase fri H2O	Op til 20	-
10×transskriptionsbuffer	2	1×
CTP/GTP/ATP/UTP (100 mM hver)	2 hver	10 mM hver
Skabelon DNA	1 µg	-
T7 RNA polymerase blanding	2	-

Bemærkninger:

1. Reaktionen konfigureres ved stuetemperatur. Da 10× transkriptionsbuffer indeholder spermidin, kan den høje koncentration af spermidin forårsage DNA-skabelonudfældning ved lav temperatur.
   Til korte transkriptioner (<100 nt) kan 2 µg skabelon anvendes, transkriptionstiden forlænges til 4-8 timer.
   3. For lange transkripter (>1000 nt), anbefales det at bruge lineariserede plasmider som skabeloner til transkription.
   4. Udfør reaktionen i PCR-instrumentet med det varme låg åbent for at forhindre fordampning.
   5. Reaktionsproduktet kan have et hvidt bundfald. Bundfaldet er magnesiumpyrophosphat produceret af de frie pyrophosphat- og magnesiumioner i reaktionsopløsningen, hvilket ikke påvirker de efterfølgende forsøg. Hvis du vil fjerne det, kan du tilføje noget EDTA. Hvis tilsætningen af ​​EDTA påvirker efterfølgende forsøg, kan supernatanten også genvindes ved centrifugering.
   6. Opbevar reagenserne og beholderne uden RNase-kontamination.

C. Inkuber ved 37°C i 2 timer

Bland komponentopløsningen, centrifuger kortvarigt til bunden af ​​røret, og inkuber ved 37°C i 2 timer. Hvis transskriptionslængden er mindre end 100 nt, forlænges reaktionstiden til 4-8 timer.

D.DNase I-behandling (valgfrit)

Når reaktionen er afsluttet, tilsættes 2 μL DNase I (RNase-fri) til hvert rør og inkuberes ved 37 °C i 15 minutter for at fjerne skabelon-DNA'et.

Ofte stillede spørgsmål

1. Lavt afskriftsudbytte

Kvaliteten af ​​skabelonen er tæt forbundet med udbyttet. Udbyttet af forsøgsgruppen er signifikant lavere end kontrolgruppen. De mulige årsager er:

• Den eksperimentelle skabelon indeholder hæmmende komponenter;
• Skabelonen er måske noget galt.

Forslag: ① Rens skabelonen igen; ② Bestem skabelonkvantificeringen og dens integritet; ③ Forlæng reaktionstiden; ④ Øg mængden af ​​skabeloninput; ⑤ Brug andre promotorer og andre RNA-polymeraser.

2. Lavt udbytte af korte afskrifter

Korte skabelonfragmenter kan hæmme reaktionen. Når transkriptionsproduktet er mindre end 100 nt, hvis du ønsker at øge udbyttet, forlænges reaktionstiden til 4-8 timer eller øges mængden af ​​skabelon til 2 μg.

3. RNA-transkriptionslængden er større end forventet

Hvis elektroforeseresultatet viser, at produktbåndet er større end den forventede størrelse, kan mulige årsager være: ① Plasmidskabelonen er muligvis ikke fuldstændig lineariseret; ②3'-enden af ​​sense-strengen har en fremtrædende struktur; ③ RNA'et har en sekundær struktur, som ikke er fuldstændig denatureret.

Forslag: ①Tjek om skabelonen er fuldstændig lineariseret, og udfør om nødvendigt yderligere linearisering; ②Vælg et passende restriktionsenzym for at undgå 3'-overhæng, eller brug Klenow Fragment/T4 DNA-polymerase til at fuldføre transkriptionen, før du fortsætter; ③Brug denatureret gel til at detektere RNA-produkter.

4. RNA-transkriptionslængden er mindre end forventet

Hvis elektroforesen viser, at produktbåndet er mindre end den forventede størrelse, de mulige årsager er: ①Skabelonen indeholder en termineringssekvens svarende til T7 RNA-polymeraseterminator; ②GC-indholdet af skabelonen er for høj.

Forslag: ①Sænk reaktionstemperaturen (f.eks. 30°C). Nogle gange kan en sænkning af temperaturen bidrage til at forlænge transskriptionslængden, men det kan det reducere udbyttet. Prøv andet RNA-polymeraser til transkription; ②Hvis skabelon-GC-indholdet er højt, udfør reaktionen ved 42℃ eller tilføj SSB for at øge udbyttet og transkriptionslængden.

5. Elektroforetisk tailing af transkriptionelle produkter

Haledannelse under elektroforese kan være forårsaget af: ① RNase-kontamination under den eksperimentelle operation; ②DNA-skabelonen er kontamineret med RNaser.

Forslag: ①Brug RNase-fri pipettespidser og EP-rør, brug latex-engangshandsker og -masker, og alle reagenser er forberedt med RNase-fri H₂O. ②Genrens skabelon-DNA'et.

Bestillingsoplysninger

Produktnavn	Katalognummer	Sspecificering
T7 High Yield RNA Synthesis Kit	10623ES	50/100/500 T
T7 RNA Polymerase GMP-kvalitet (250 U/μL)	10625ES	10KU/100KU/2500KU/25MU
Pyrophosphatase, uorganisk GMP-kvalitet (1 U/μL)	10620ES	10U/100U/1000U
Murin RNase-hæmmer GMP-grad (40 U/μL)	10621ES	10KU/20KU/100KU/1MU
mRNA Vaccinia Capping Enzyme GMP-kvalitet	10614ES	2KU/10KU/100KU
mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase GMP-kvalitet	10612ES	10KU/50KU/250KU
Deoxyribonuclease I (DNase I) GMP-kvalitet	10611ES	500/2000/10000 U
Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit	12603ES	24/96 T