På trods af at den har opnået gode resultater under pandemien og vist et stort potentiale, har mRNA-teknologien stadig flere begrænsninger, såsom korte ekspressionstider og begrænset proteintranslation. Selvom disse funktioner kan give et vist niveau af sikkerhed, bliver de begrænsninger for terapier som proteinerstatning. Dette kræver gentagen dosering for at opretholde proteinekspressionsniveauer, hvilket introducerer nye risici og udfordringer såsom immunogenicitet og neutraliserende antistoffer.
Selvforstærkende RNA (saRNA) kan generere det samme immunrespons ved doser hundreder eller endda tusindvis af gange mindre end traditionelt mRNA. Lavere doser betyder lavere produktionsomkostninger, og mindre hyppige injektioner kan reducere potentielle toksiske bivirkninger fra mRNA og leveringsvektorer. I øjeblikket er flere saRNA-kandidater gået ind i kliniske forsøg verden over. Store virksomheder som BioNTech udvikler aktivt saRNA-teknologipipelines.
Selvom saRNA tilbyder betydelige omkostnings- og sikkerhedsfordele, giver dets unikke struktur nye produktionsudfordringer. saRNA-molekylet, som kombinerer sekvensen, der koder for RNA-polymerase med målproteinsekvensen, er meget større (~10 kb) og mere kompleks (indeholder flere sekundære strukturer) end traditionelt mRNA. Dette øger betydeligt vanskeligheden ved in vitro transkriptionsreaktioner, hvilket reducerer udbyttet og renheden af saRNA-produktion. Derfor kræver saRNA-produktion højere standarder i syntese-, separations- og oprensningsprocesser.
Affinitetskromatografi, en metode, der bruges til separation og oprensning, har problemer som lavt målproduktudbytte og integritet. At kombinere flere kromatografiske oprensningsmetoder (f.eks. tilføjelse af cellulosekromatografi, hydrofob omvendt-fase-kromatografi) er besværligt, introducerer nye urenheder, har lave genvindingshastigheder og er dyrt. Derudover er IVT-reaktionssystemet, der bruges til produktion i stor skala, optimeret fra systemer, der er egnede til at syntetisere 100nt nukleinsyresekvenser, hvilket gør det uegnet til saRNA, som overstiger 10 kb i størrelse. Dette nødvendiggør optimering af eksisterende IVT-reaktionssystemer. I øjeblikket kan konventionelle mRNA-oprensningsmetoder ikke opfylde industrielle kvalitetskrav for rå væske. Derfor er der et presserende behov for at udvikle og optimere en komplet og effektiv industriel separations- og oprensningsproces for selvforstærkende RNA.
Optimering af industriel produktion og oprensningsmetoder
For at udvikle et industrielt produktionssystem til selvforstærkende mRNA (saRNA) er det vigtigt først at optimere bufferiontyperne og komponenterne i IVT-cotranskriptionssystemet i lille skala. Dette involverer også raffinering af den kromatografiske buffer og prøvevaskningsforhold til nedstrøms oprensningsprocesser. Disse optimerede forhold kan derefter skaleres op til produktion i stor skala for at verificere, om systemet effektivt kan øge produktionskapaciteten og forbedre kvaliteten af råproduktet.
Cotranscription Cap-Adding Reaction System
I cotranscription cap-adding reaktionssystemet inkluderer T7 bufferkomponenterne 400mM HEPES, 20mM spermidin, 100mM DTT og Mg2+ salte.
T7 Buffer - Magnesium Ion Salt Type
Den anvendte type magnesiumionsalt påvirker udbyttet og integriteten af mål-saRNA-produktet.
- Til småskala cotranskriptionssyntese af 1mg mRNA resulterer anvendelse af Mg(OAc)2 som Mg2+-saltet i det bedste udbytte og integritet med værdier på henholdsvis 100,5 µg og 62,9%.
- I modsætning hertil reducerer anvendelse af andre magnesiumionsalte såsom MgCl2 og MgSO4 udbyttet med ca. 25-50% og integriteten med ca. 10%, hvilket sænker både udbytte og integritet betydeligt.
T7 Buffer - Magnesium Ion Koncentration
En optimal koncentration af magnesiumacetationer (30-50 mM) øger udbyttet og integriteten af mål-saRNA'et med de bedste resultater ved 35 mM.
- Ved en magnesiumacetat-ionkoncentration på 30-50 mM når saRNA-udbyttet 88,5-100,5 µg, og integriteten er 58,6-62,9%, hvilket viser gode resultater.
- Ved en koncentration på 35 mM er udbyttet og integriteten på deres højeste og når henholdsvis 100,5 µg og 62,9 %.
T7 Buffer - Magnesium Ion Salt Kombineret med Andre Salte
Tilføjelse af andre salte til T7-bufferen kan betydeligt forbedre udbyttet og integriteten af målproduktet.
- Base T7 bufferen inkluderer 400 mM HEPES, 20 mM spermidin, 100 mM DTT og Mg2+ salte, hvilket resulterer i et udbytte og integritet på henholdsvis 100,5 µg og 62,9 %.
- Tilsætning af et andet salt, NaOAc, øger udbyttet og integriteten yderligere: udbyttet øges med 20-110 µg, og integriteten forbedres med ca. 2-8%.
T7 Buffer - Koncentration af kombinerede salte
Når den anden saltkomponent NaOAc (Na+) er i en koncentration på 5-30 mM, forbedres målsaRNA-udbyttet og integriteten signifikant, med den bedste koncentration ved 15 mM.
- Ved Na+-koncentrationer på 3-30 mM når saRNA-udbyttet 120-210 µg, og integriteten er 64,4-70,2 %, hvilket viser gode resultater.
- Ved en Na+-koncentration på 15 mM er udbyttet og integriteten på deres højeste og når henholdsvis 210 µg og 70,2 %.
Enkelte oprensningsmetoder
Under småskala (<50mg) saRNA-produktion og -rensning kan anvendelse af forskellige oprensningsmetoder reducere dsRNA-indholdet og proteinrester markant, hvilket sikrer højt udbytte, dækningseffektivitet og produktintegritet. Effektiviteten af oprensningsmetoderne fra bedst til værst er: affinitetskromatografi > lithiumchloridudfældning > ultrafiltrering, cellulosekromatografi.
-
Affinitetskromatografi
Til storskala mRNA-produktion foretrækkes kromatografi. Mulighederne omfatter omvendt fase, ionbytning, hydrofob og affinitetskromatografi, hver med sine fordele og ulemper. Affinitetskromatografi, der ofte bruges til at fange poly(A) mRNA, tilbyder skalerbarhed og platformløsninger med >90 % genvindingshastigheder.
mRNA's centrale strukturelle træk, 5'-hætten og 3'-poly(A)-halen, letter oprensningen. Affinitetskromatografi, svarende til magnetisk perleoprensning, bruger dT-bundne perler til at fange poly(A)-hale-mRNA. Høje saltforhold beskytter negative ladninger, hvilket tillader binding gennem AT-hydrogenbindinger, og mRNA elueres under mild neutral pH og lav ledningsevne.
Affinitetskromatografi for RNA involverer "høj saltbinding, eluering med lavt saltindhold." Buffersammensætning, molekylstørrelse, temperatur og prøvekoncentration påvirker processen væsentligt. Valg af den optimale salttype og -koncentration gennem eksperimentering er afgørende for effektiv oprensning.
Oprensning: Denne metode giver den højeste produktintegritet (80,3 %), det laveste dsRNA-indhold (0,01 µg/mg), den højeste dækningseffektivitet (96,4 %) og de mindste proteinrester (1,20 µg/mg), med et udbytte på 136 µg og en genvindingsgrad på 65 % af produktets renhed og kvalitet.
-
Andre oprensningsmetoder:
Lithiumchloridudfældning
Princippet for oprensning af mRNA ved hjælp af LiCl er, at lithium kan reducere elektrostatisk frastødning mellem molekyler ved en bestemt pH, hvilket muliggør effektiv RNA-udfældning.Bundfaldet separeres derefter ved centrifugering, opløses for at opnå en ren RNA-prøve. LiCl-udfældning er enkel, hurtig, effektiv til mRNA'er af forskellige størrelser og giver produkter med høj renhed. Imidlertid kan resterende lithiumioner hæmme mRNA. Det anbefales at bruge LiCl-udfældning til opløsninger, der indeholder mindst 400 µg/ml RNA for at sikre oprensningseffektivitet. Denne metode giver et højt udbytte (210 µg), men produktets integritet er kun 70,2 %, hvilket reducerer produktkvaliteten markant. Det er ikke egnet til produktion i stor skala.
Magnetisk perlemetode:
Magnetiske perler er små partikler, der bevæger sig retningsbestemt under et magnetfelt, typisk sammensat af en jernoxidkerne og en ekstern belægning. Magnetisk perleoprensning er en almindelig molekylærbiologisk teknik til hurtigt og effektivt at berige mRNA-molekyler fra blandinger. Forskellige funktionelle magnetiske perler har forskellige overfladefunktionelle grupper (f.eks. hydroxyl, carboxyl, Oligo(dT), streptavidin) til oprensning af forskellige biomolekyler.
Carboxylerede magnetiske perler kan effektivt rense nukleinsyrer med mRNA-molekyler, der binder gennem elektrostatiske interaktioner under sure forhold. Justering af betingelser giver mulighed for selektiv binding og frigivelse af mRNA. Længere mRNA'er med mere eksponerede negativt ladede fosfatgrupper binder lettere til perlerne. For kortere mRNA'er kan større perlevolumener være nødvendige. Oligo(dT)-koblede magnetiske perler, svarende til affinitetschromatografi, udnytter specifik binding mellem poly(A)-halen af mRNA og perlernes Oligo(dT).
Ultrafiltrering
Denne metode resulterer i den laveste saRNA-integritet, ca. 8 % lavere end affinitetskromatografi, med den højeste proteinrest (4,58 µg/mg).
Cellulosekromatografi
Denne metode opnår lavt dsRNA-indhold (0,009 µg/mg) og en høj capping rate (96,4%). Proteinrester er dog lidt højere (5,30 µg/mg), med en genvindingsgrad på kun 57 % og et udbytte på 120 µg, som begge er væsentligt lavere end dem, der opnås med affinitetskromatografi (med henholdsvis ca. 10 % og 16 µg).
Oprensningsproces
Kromatografiske bufferkomponenter - Tilsætning af reduktionsmidler
Tilføjelse af reduktionsmidler til den kromatografiske buffer under oprensning kan forbedre produktintegriteten, genvindingshastigheden og dækningseffektiviteten betydeligt, samtidig med at niveauerne af biprodukt dsRNA og proteinrester reduceres sammenlignet med ikke tilsætning af reduktionsmidler.
- Uden reduktionsmidler:
- Udbytte: 136 µg
- Gendannelsesrate: 65 %
- Integritet: 80,3 %
- dsRNA: 0,01 µg/mg
- Afdækningseffektivitet: 96,4 %
- Proteinrest: 1,20 µg/mg
- Produktets renhed og kvalitet er god.
- Med reduktionsmidler (TCPE, DTT, β-mercaptoethanol):
- Udbyttet stiger med 10-40µg
- Gendannelsesraten stiger med 5-18 %
- Integriteten forbedres med cirka 1-5 %
- Afdækningseffektivitet: 96,4 %
- dsRNA: så lavt som 0,005 µg/mg
- Proteinrest: så lavt som 0,20 µg/mg
- Betydelig forbedring af produktets renhed og kvalitet.
Kromatografiske bufferkomponenter - typer af reduktionsmidler
Forskellige typer reduktionsmidler tilføjet til den kromatografiske buffer kan yderligere forbedre produktintegritet, genvindingshastighed og dækningseffektivitet, samtidig med at dsRNA og proteinrester reduceres. TCPE har vist sig at være det mest effektive reduktionsmiddel.
- Med TCPE:
- Udbytte: 175 µg
- Gendannelsesrate: 83 %
- Integritet: 85,2 %
- dsRNA: 0,005 µg/mg
- Afdækningseffektivitet: 96,4 %
- Proteinrest: 0,20 µg/mg
- Fremragende produktrenhed og kvalitet.
Kromatografiske bufferkomponenter - Koncentration af reduktionsmidler
Tilføjelse af reduktionsmidler i en koncentration på 5-15 mM i den kromatografiske buffer kan forbedre produktintegriteten, genvindingshastigheden og dækningseffektiviteten betydeligt, samtidig med at dsRNA og proteinrester reduceres. Den optimale koncentration er 10mM.
- Tilføjelse af 5-15mM TCPE:
- Udbytte: 160-178 µg
- Gendannelsesrate: 76-85 %
- Integritet: cirka 85 %
- dsRNA: 0,002-0,005 µg/mg
- Afdækningseffektivitet: 96,4 %
- Proteinrest: 0,20-0,52 µg/mg
- God produktrenhed og kvalitet.
- Med 10mM TCPE:
- Udbytte: 178 µg
- Gendannelsesrate: 85 %
- Integritet: 85,4 %
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Afdækningseffektivitet: 96,4 %
- Proteinrest: 0,20 µg/mg
- Optimal produktrenhed og kvalitet.
Vaskeforhold
Kontrol af forholdet mellem kromatografisk buffer og injektionsvand i vaskeprocessen (10-25):(75-90) kan forbedre produktintegriteten, genvindingshastigheden og dækningseffektiviteten betydeligt, samtidig med at dsRNA- og proteinrester reduceres. Det optimale forhold er 15:85.
- Forhold (10-25):(75-90):
- Udbytte: 150-179 µg
- Gendannelsesrate: 71-85 %
- Integritet: 84-90 %
- dsRNA: 0,002-0,006 µg/mg
- Afdækningseffektivitet: 96,4 %
- Proteinrest: ca. 0,20 µg/mg
- God produktrenhed og kvalitet.
- Med forhold 15:85:
- Udbytte: 179 µg
- Gendannelsesrate: 85 %
- Integritet: 90,0 %
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Afdækningseffektivitet: 96,4 %
- Proteinrest: 0,20 µg/mg
- Optimal produktrenhed og kvalitet.
Kombinerede oprensningsmetoder
Brug af en kombination af forskellige oprensningsmetoder kan yderligere reducere niveauerne af dsRNA og proteinrester i produktet, hvilket forbedrer den overordnede kvalitet. Den foretrukne rækkefølge af oprensningsmetoder er: affinitetschromatografi > ultrafiltrering + affinitetschromatografi > affinitetschromatografi + cellulosekromatografi > cellulosekromatografi + ultrafiltrering. Affinitetskromatografi alene giver de bedste resultater.
-
Affinitetskromatografi alene:
- Udbytte: 179 µg
- Gendannelsesrate: 85 %
- Integritet: 90,0 %
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Afdækningseffektivitet: 96,4 %
- Proteinrest: 0,20 µg/mg
- Højeste produktrenhed og kvalitet.
-
Ultrafiltrering + affinitetskromatografi:
- Udbytte: 170 µg (9 µg mindre end affinitetskromatografi alene)
- Gendannelseshastighed: 81 % (4 % mindre end affinitetskromatografi alene)
- Integritet: 88,5 %
- dsRNA: 0,0015 µg/mg
- Proteinrest: 0,18 µg/mg
- Let reduktion i dsRNA og proteinrester sammenlignet med affinitetskromatografi alene, men signifikant reduktion i udbytte og genvindingshastighed. Denne metode er mere kompleks, fordobler oprensningstiden og øger omkostningerne.
-
Affinitetskromatografi + Cellulosekromatografi / Cellulosekromatografi + Ultrafiltrering:
- dsRNA: 0,005 µg/mg lavere end enkeltmetoder
- Udbytte: 60-100 µg mindre
- Gendannelsesrate: 30-40% lavere
- Øgede skridt resulterer i højere arbejds- og materialeomkostninger.
Storskala produktion
Ved produktion i stor skala, ved anvendelse af affinitetskromatografi, affinitetskromatografi kombineret med cellulosekromatografi eller ultrafiltrering kombineret med affinitetskromatografi, stiger udbyttet af selvforstærkende mRNA signifikant til 140-185 µg med en genvindingsrate på 67-88%. Produktintegritet er 93-94%, dsRNA-indhold kontrolleres inden for 0,0018-0,0020 µg/mg, dækningseffektivitet når 96,1-96,4%, og proteinrester holdes inden for 0,04-0,05 µg/mg. Dette viser god skalerbarhed og effektivitet til storskalaproduktion.
Reference:
[8] Industriel produktion og separationrensningsmetoder til selvforstærkende mRNA-råvæske og dens anvendelser [P]. Patent: CN118048418A. 2024.05.17.
Bestillingsinformation
Yeasen udviklede en ny CleaScrip™ T7 RNA-polymerase, som er et førsteklasses enzym til mRNA-syntese, for at cellulosebehandlingen ikke længere er nødvendig for dsRNA-fjernelse, hvilket sparer både tid og arbejdsomkostninger. DsRNA-indholdet i mRNA'er produceret af CleaScript™ T7 RNA-polymerase er lavere end i mRNA'er produceret af Wild Type T7 RNA-polymerase, både før og efter dsRNA-fjernelsestrinnet ved hjælp af cellulosebehandling. Tjek flere detaljer fra følgende links: