Cap-strukturen er en væsentlig komponent i udviklingen af mRNA-vacciner og terapeutika. Syntetisk mRNA-teknologi er afhængig af Cap1 for at øge stabiliteten, translationseffektiviteten og reducere den medfødte immungenkendelse af mRNA af toll-lignende receptorer (TLR'er) og andre immunsensorer, hvilket minimerer uønsket immunaktivering. Dette forhindrer uønskede inflammatoriske reaktioner og forbedrer derved stabiliteten og effektiviteten af det terapeutiske mRNA i humane celler.
Tidlig opdagelse og Cap0-struktur
I midten af 1970'erne afslørede forskning i eukaryotisk mRNA en 5'-terminal struktur nu kendt som Cap0, hvor en N7-methylguanosin-hætte (m7G) er knyttet til det første nukleotid i 5'-enden. Denne modifikation viste sig at beskytte mRNA mod nedbrydning af exonukleaser, hjælpe med nuklear eksport og fremme ribosomgenkendelse til translationsinitiering. Cap0 var den første karakteriserede hættestruktur, med dens methylering begrænset til selve guanosinhætten. Opdagelsen af denne 5'-cap og dens funktioner markerede et betydeligt gennembrud i forståelsen af eukaryote mRNA-hætter og deres rolle i mRNA-modifikationer.
Fremkomsten af Cap1
Cap1-strukturen, et kritisk træk ved eukaryotisk mRNA, spiller en central rolle i mRNA-stabilitet, translation og immungenkendelse. mRNA cap-strukturen, der består af en N7-methylguanosin (m7G) koblet til det første nukleotid via en 5'-5' triphosphatbinding, udviklede sig fra tidlige undersøgelser af eukaryot mRNA post-transkriptionelle modifikationer i 1970'erne.
Struktur af 5'-ende capped mRNA'er.【1】 Yderligere undersøgelser viste, at i de fleste eukaryote mRNA'er er det første nukleotid efter cap (position +1) også methyleret i 2'-O positionen af ribosen, en proces kendt som 2'-O-methylering. Denne opdagelse, kendt som Cap1-strukturen (m7GpppNm), tilføjede endnu et lag af funktionel betydning til mRNA-modifikationer. Cap1-modifikationen viste sig at finjustere mRNA-stabilitet og forhindre immungenkendelse af det medfødte immunsystem, især i pattedyrsceller, hvor den hjælper med at undgå genkendelse af mønstergenkendelsesreceptorer som RIG-I, TLR'er og MDA5【2】. Dette var afgørende for både mRNA-metabolisme og udviklingen af mRNA-baserede teknologier, herunder mRNA-vaccination og genterapiapplikationer.
Tekniske udfordringer i mRNA-industrien og nuværende løsninger
Der er stadig flere tekniske udfordringer i den udbredte anvendelse og optimering af mRNA-vacciner, herunder problemer med højdosis-mRNA, immunresponser, stabilitet og levering. En væsentlig udfordring i mRNA-industrien er behovet for høje doser af mRNA for at fremkalde et robust immunrespons. Dette skyldes flere faktorer:
Hurtig nedbrydning: mRNA er i sagens natur ustabilt og modtageligt for nedbrydning ved afdækning af enzymer og ribonukleaser (RNaser), der er til stede i biologiske systemer.
Begrænset translationel effektivitet: Effektiviteten, hvormed mRNA oversættes til protein, kan variere, hvilket kræver større mængder af mRNA for at generere tilstrækkelige antigenniveauer til et immunrespons. Oversættelseseffektiviteten er relateret til affiniteten af Cap1 og translationsinitieringsfaktor eIF4E.
Dannelsen af det grundlæggende oversættelsesinitieringskompleks i eukaryoter.【3】
Immunogenicitet og uønskede immunreaktioner: Den tredjestørste forhindring er det medfødte immunrespons, der kan udløses af selve mRNA'et, især for dsRNA eller ufuldstændigt mRNA. Mens et vist niveau af immunaktivering er ønsket for at stimulere det adaptive immunsystem, kan overdreven aktivering føre til inflammatoriske reaktioner, som kan reducere vaccinens effektivitet eller forårsage bivirkninger.
Afdækning af teknologihistorie
-
Enzymatisk afdækningsteknologi: Enzymatisk dækning, introduceret i de tidlige dage af mRNA-forskning, involverer anvendelse af dækningsenzymer som guanylyltransferase og methyltransferase til at tilføje en naturlig 5'-hætte post-transkriptionelt. Denne metode sikrer høj pålidelighed og dækningseffektivitet i mRNA-translation, især til terapeutiske anvendelser.
-
Syntetiske hætteanaloger (1980'erne-2000'erne): Forskere udviklede syntetiske cap-analoger til in vitro-syntese af capped mRNA, der hjælper med at studere mRNA-funktion og genekspression. Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) er en syntetisk cap-analog designet til at forhindre forkert cap-inkorporering under mRNA-syntese, hvilket forbedrer translationseffektiviteten af mRNA til vacciner og genterapier. Imidlertid er afdækningseffektiviteten og udbyttet af ARCA-afdækning lav.
-
Cap1 Technology (2010'erne): Cap1 co-transkriptionel capping-metode, der forenkler processen ved at inkorporere hætten direkte under mRNA-syntese. Denne metode øger effektiviteten og giver en høj procentdel af korrekt lukket mRNA, hvilket gør den ideel til terapeutiske anvendelser i stor skala som mRNA-vacciner.
I øjeblikket har enzymatiske dækningsteknologier været afgørende i udviklingen af mRNA-baserede terapier, herunder COVID-19-vacciner, der sikrer stabilitet og effektiv oversættelse af terapeutisk mRNA.
Sammenligning af enzymatisk dækning, næste generation LZCap Capping og den første generation af Capping (ARCA) metode
Udvikling af næste generation af cap-analoger
Vi havde til formål at udvikle cap-analoger med resistens over for decapping-enzymer, høj affinitet til eIF4E for at forbedre translationseffektiviteten og lavere immunogenicitet. Disse fremskridt er afgørende for at øge effektiviteten af mRNA-baserede terapier, herunder anti-kræftbehandlinger og genterapiapplikationer.
Design af LZCap
Ved udformningen af LZCap fokuserede vi hovedsageligt på at skabe en cap-analog med høj affinitet til eIF4E. Enzymer har en relativt "specifik" genkendelse af substrater. Derfor, når vi designer en ny kasketstruktur, stræber vi efter så vidt muligt at bevare ligheden med naturlige/kendte strukturer. Den naturlige struktur har en ribose 3' OH, som kan modificeres (f.eks. methylering). Baseret på denne betragtning valgte vi at tilføje et carbon ved 3'-positionen for nyhed, efterfulgt af en NH for at efterligne hydrogenbindingen af OH, og derefter en acetylgruppe for at reducere NHs basicitet og forbedre dens hydrogenbindingsevne. Aktiviteten af LZCap er bedre end methyleret naturlig cap, muligvis på grund af øget hydrogenbinding. Sammenlignet med methyl- og methoxygrupperne kan acetylaminogruppen også øge van der Waals interaktioner mellem substratet (cap) og den initierende faktor (enzym).
Stabilitet af acetylaminogruppen
Acetylaminogruppen er allerede tilstrækkelig stabil. Det er meget mere stabilt end den 7-methylerede position og phosphodiesterbindingen, som er de mindst stabile dele af hætten.
Udbytte og dækningseffektivitet af LZCap
Med LZCap AG(3'Acm) cap er luciferase mRNA capping effektiviteten omkring 97,59%, og op til 200 μg capped mRNA kan opnås med 1 μg DNA skabelon i en standard in vitro transkriptions (IVT) reaktion med T7 RNA polymerase. mRNA-renheden er op til 99% efter simpel LiCl-udfældning. Denne høje dækningseffektivitet og udbytte gør LZCap til en attraktiv mulighed for forskellige applikationer, herunder proteinproduktion og genterapi.
Cap-strukturen er en væsentlig komponent i udviklingen af mRNA-vacciner og terapeutika.Syntetisk mRNA-teknologi er afhængig af Cap1 for at forbedre stabiliteten, translationseffektiviteten og reducerer den medfødte immungenkendelse af mRNA af toll-lignende receptorer (TLR'er) og andre immunsensorer, hvilket minimerer uønsket immunaktivering. Dette forhindrer uønskede inflammatoriske reaktioner og forbedrer derved stabiliteten og effektiviteten af det terapeutiske mRNA i humane celler.
| Produkt | Kasket AG (3'-Omig-7mG) | LZCap AG(3'Acm) | AG (ingen dækning) |
| mRNA-udbytte (μg) | 164 | 173 | 200 |
MS-analyse af capping-effektiviteten af LZCapped Luciferase mRNA med RNAse H-baseret metode. Afdækningseffektiviteten er omkring 97,59 %,
Hvordan er mRNA-stabiliteten over for det decapping-enzym
mRNA'er med LZCap AG(3'Acm) og LZCap AG M6 (3'Acm) viser højere resistens over for decapping-enzymet (NEB). Det bemærkes, at CapM6 (3'-OMe-6mA-7mG) også er resistent over for decapping-enzym, men den almindelige Cap AG (3'-OMe-7mG) viser ikke resistensen.
Hvordan er bindingsaffiniteten af LZCap til eIF4E?
Hvad med proteinekspressionen af LZCap AG(3'Acm) capped mRNA?
Ekspressionen af LZCap AG(3'Acm) capped luciferase mRNA er signifikant højere end den af Cap1 analogen (3'-OMe-7mG) capped mRNA i forskellige cellelinjer* (3T3-L1，Hela，JAWs， HEK293T og Huh7)，De 130 gange højere LC-gentagelsesforsøg viste ca. AG(3'Acm) capped luciferase mRNA end (3'-OMe-7mG) capped mRNA i gennemsnit. Lignende resultat observeres hos mus. Proteinekspressionsniveau kan variere lidt med forskellige mRNA-sekvenser.
Har du flere dyredata?
Ekspressionseffektiviteten af LZCap AG(3'Acm) eller LZCap AG(3'FMom) afgrænset
GLuc-kodende mRNA viser en højere in vivo-ekspression i forhold til CapAG (3'-OMe-7mG) capped mRNA'er i Cynomolgus Monkey and Pig.
Hvad med den medfødte immunogenicitet af LZCap AG capped mRNA'er?
LZCapAG (3'Acm) capped mRNA'er viser lav medfødt immunogenicitet. TLR8, TLR7, IL-1A og B spiller en vigtig rolle i immunresponset induceret af uafskærmet RNA. In vivo-undersøgelserne af LZCapped mRNA-immunogenicitetsanalyse viste, at uafsluttet RNA forårsagede signifikante ændringer i transkriptionsniveauet af immunrelaterede faktorer hos mus. Både LZCap og 3'-OMe-7mG capped mRNA'er viser lignende lavere immunfaktor transkriptionsniveau i mus efter en enkelt RNA-stimuleret injektion.
Har du lavet en sikkerhedstest?
Ja, vi lavede Cytotoxicity Test, Human Polymerase Inhibition Study og Ames Test.
- Der er ingen eller ringe cytotoksicitet observeret for nukleosidmonomeren af 3'-Acm-7mG (CC50＞10000nM) i 293T、Huh7、MRC5、THP1 og U87MG celler.
- Human DNA-polymerase (α,β, γ og Klenow) og mitokondriel RNA-polymerase (hPOLRMT) aktivitetsinhiberingsundersøgelser viser, at 3'-Acm-7mG TP ikke hæmmer humant DNA eller RNA-polymerase.
- Den bakterielle omvendte mutationstest (Ames) påviser associerede genetiske ændringer såvel som genotoksiske kræftfremkaldende stoffer i de fleste gnavere og mennesker. Ames-test viste, at 3'-Acm-7mG ikke har genotoksicitet.
Er dette produkt blevet patenteret?
Ja. Patentet er udstedt i USA.
Bestillingsoplysninger
| Produktnavn | Specifikationer | Katalog nr. |
| LZCap AG(3'Acm)（ 100 mM） | 100 μL, 1 mL | 10684ES |
| LZCap AU(3'Acm)( 100 mM） | 100 μL, 1 mL | 10685ES |
| LZCap GG(3'Acm)（ 100 mM） | 100 μL, 1 mL | 10686ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy5)（ 25 mM) | 100 μL, 1 mL | 10688ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy7)( 25 mM） | 100 μL, 1 mL | 10689ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Cy3) (25 mM) | 100 μL, 1 mL | 10687ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Biotin) (25 mM) | 100 μL, 1 mL | Forespørgsel |
| LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 mM) | 100 μL, 1 mL | Forespørgsel |
| LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 mM) | 100 μL, 1 mL | jegforespørgsel |
| LZCap (AG(3'Acm) Firefly luc mRNA (1μg/μL) | 100 μL, 1 mL | jegforespørgsel |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP mRNA (1μg/μL) | 100 μL, 1 mL | jegforespørgsel |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP saRNA (1μg/μL) | 100 μL, 1 mL | jegforespørgsel |
| LZCap (AG(3'Acm) RFP mRNA (1 μg/μL) | 100 μL, 1 mL | Forespørgsel |
| LZCap (AG(3'Acm) Cas9 mRNA (1μg/μL) | 100 μL, 1 mL | jegforespørgsel |
| LZCap (AG(3'Acm) Gluc mRNA (1μg/μL) | 100 μL, 1 mL | jegforespørgsel |
Reference:
- Molekylære mekanismer for coronavirus RNA-afdækning og methylering, Virologica Sinica 31(1)
- mRNA-vacciner - en ny æra inden for vaccinologi. Nat. Rev. Drug. Discov. 17, 261-279 (2018).
- Translationsinitiering reguleret af RNA-bindende protein hos pattedyr: Modulationen af translationsinitieringskomplekset af transvirkende faktorer, celler 2021, 10(7), 1711