Denne artikel beskriver anvendelsen af Concanavalin A og dets kovalente kobling med magnetiske perler.
Del 1. Concanavalin A
Concanavalin A-coated Magnetic Beads (ConA-perler), som navnet antyder, er biomagnetiske perler, hvori plantelektinet Concanavalin A (ConA) er koblet sammen med superparamagnetiske nanomaterialer. Det følgende er en kort introduktion til ConA Magnetic Beads.
Concanavalin A (ConA), et plantelektinprotein uden blodgruppespecificitet, var det første plantelektinprotein, der blev isoleret og oprenset og krystalliseret fra blækspruttebønne (Canavalia ensiformis, Pennisetum maritimum) siden 1936.
ConA har 2 hovedformer afhængigt af pH-værdien af opløsningen, hvori det er til stede: α-2-homodimeren eller α-4-homotetrameren [2]. Under alkaliske betingelser (pH>7,0) eksisterer den som en tetramer (bestående af fire molekylvægtsunderenheder på 26 kDa); under sure betingelser (pH 4,5-5,5) Con A dissocieres til en aktiveret dimer struktur (52 kDa). Derudover påvirkes ConA's funktion af divalente kationer, fx i fravær af metalioner (Ca)2+ og Mn2+), dets konformation og glycoproteinbindingsfunktion kan ikke realiseres[1].
Fig. (1). Molekylær modellering af (A) ConA monomer, (B) ConA dimer, (C) ConA tetramer med mannose, glucose og metalioner.
Del 2. Perler
Biomagnetiske perler er en klasse af magnetiske mikrosfærer med nanometerpartikelstørrelse, dannet af polymerer og uorganiske magnetiske nanopartikler. Magnetiske perler kan klassificeres i tre hovedkategorier i henhold til deres struktur: kerne-skal type struktur, sandwich type struktur og diffus type struktur. Magnetiske materialer omfatter rent jernpulver, carbonyljern, magnetisk malm, orthoferrit og jernkoboltlegering, et al.
Magnetiske nanomaterialer, på grund af deres specielle effekter, såsom lille størrelse effekt, overfladeeffekt og kvantestørrelse effekt osv., i størrelsen af Fe3O4 nanopartikler er mindre end 30 nm, interferensen af den termiske forstyrrelse inde i nanopartiklerne er betydelig, og på dette tidspunkt viser disse nanopartikler en særlig magnetisk egenskab, dvs. superparamagnetisme. Superparamagnetisk Fe3O4 nanopartikler er meget udbredt i den biologiske industri på grund af deres højkvalitetsegenskaber, såsom ikke-toksicitet, god biokompatibilitet, unikke magnetiske målretningsegenskaber og lette varmegenerering i vekslende magnetfelter.
I modsætning hertil har kovalent kobling af ConA med mikrosfærer til immobilisering af biomolekyler følgende fordele:
- Høj stabilitet af kovalent koblingsbinding for reproducerbarhed;
- Ligand ConA-binding på overfladen af mikroperler til målmolekyle-interaktioner;
- Kinetisk karakterisering af opløsningsmiljøet, velegnet til biologisk eksperimentel manipulation;
Del 3. Anvendelse af ConA magnetiske perler
Som rapporteret i litteraturen er de vigtigste anvendelser af ConA magnetiske perler kategoriseret i 3 scenarier, som udfører cytoplasmatisk membranseparation, glycoproteinberigelse og adskillelse af immobiliserede cellulære aspekter.
Anvendelse I: Cytoplasmatisk membranseparation
Anvendelse af ConA magnetiske perler påvirket af aktivering af divalente kationer, så det eksisterer i Ca2+ og Mg2+ opløsningsmiljøer, som besidder funktionen af affinitetsinteraktion af terminal α-D-mannosyl og α-D-glucosyl, anvendt i plasmamembranoprensningen, er en enkel og effektiv måde. For eksempel er plasmamembranseparation af celler eller væv et nøgletrin for yderligere at opnå plasmamembranproteiner. ConA er i stand til at binde glycosylerede proteiner på celler, og dette princip kan bruges til at opnå en plasmamembran med højere renhed. De vigtigste operationstrin er: immobilisering af ConA på magnetiske perler ved at binde biotinyleret ConA til streptavidin magnetiske perler; inkubation af cellemembraner med ConA magnetiske perler i 1 time; adsorption på et magnetisk stativ; vask med TBS i 5 gange; og eluering af cytoplasmatisk membranopløsning med eluent[3].
Fig. 2. ConA magnetiske perler rensningstrin for plasmamembran
Anvendelse II: Glycoproteinberigelse
ConA er specifik for mannose og glucose og genkender α-konjugeret mannose, som tilfældigvis er "kerneoligosaccharidet" i mange serum- og cellemembranglykoproteiner. Derfor kan det bruges i immunologi til at adskille glycosylerede molekyler såsom glycoproteiner i celle- eller vævslysater eller serum.
En stor procedure var det ved at tværbinde aminosilaniserede magnetiske nanoperler (MNP'er) med ConA via en bifunktionel linker, bis-N-hydroxysuccinimid linoleat (DSS), for at opnå ConA magnetiske perler; at afslutte den ikke-specifikke binding af de magnetiske nanoperler ved hjælp af methoxyethylenglycol (MEG) og at udføre den magnetiske adskillelse; at tilsætte ekstraktet af de cellulære membranproteiner fordøjet med trypsin for at inkubere både de magnetiske ConA-perler og de indfangede glycopeptider og til sidst at eluere de opfangede glycopeptider og udføre vakuumtørring. ConA magnetiske perler blev begge inkuberet, de ConA magnetiske perler, der havde bundet glycoproteiner, blev opsamlet af det magnetiske stativ, de ikke-glycopeptider blev vasket, og til sidst blev de opfangede glycopeptider elueret og vakuumtørret. Denne metode tillader dybdegående analyse af specifikke glycosyleringssteder af tumorassocierede proteiner (f.eks. EGFR)[4].
Fig. 3. Superparamagnetiske nanopartikler koblet til forskellige lektiner
Anvendelse III: Isolering af immobiliserede celler
Anvendelsen af ConA magnetiske perler (magnetiske perler, der er kovalent bundet til højrenhedsledsager Concanavalin A) til at binde til glycoproteiner på cellemembraner eller kernemembraner og derved indfange celler eller kerner, tillader visualisering af eksperimentel manipulation af små antal celler. For eksempel bruges ConA magnetiske perler i CUT&Tag og CUT&RUN [5] eksperimenter, som er nye teknikker, der bruges til at studere strukturen og funktionen af kromatin, og som immobiliseres ved at binde ConA magnetiske perler til cellerne for at visualisere operationen og undgå problemet med celletab forårsaget af centrifugering.
Sammenlignet med den traditionelle ChIP-seq-teknologi til undersøgelse af DNA-protein-interaktioner har CUT&Tag og CUT&RUN følgende fordele:
- ConA magnetiske perler binder til cellemembranglykoproteiner for at visualisere operationen og forbedre den eksperimentelle operationsoplevelse;
- Intet behov for centrifugering, kun ConA magnetiske perler adsorberet på det magnetiske stativ for at fuldføre adskillelsen af celleprøver og opløsninger;
- Kan betjenes med så lave som 10 celler, hvilket omgår behovet for et stort antal prøver til ChIP-seq.
Fig. 4. Skematisk diagram af ChIP-seq, CUT&Tag, CUT RUN eksperimentflow
Del 4. YEASEN Concanavalin A-coated magnetiske perler
ConA magnetiske perler, udviklet af YEASEN, er i stand til at binde sig til glycoproteiner, glycolipider, polysaccharider og andre molekyler med glykosyleringsmodifikation på en hurtig, effektiv, følsom og specifik måde efter strengt råmaterialevalg og flere procesoptimeringer og forbedringer. Det bruges hovedsageligt til celleisolering eller til isolering af glycosylerede molekyler såsom glycoproteiner i celle- eller vævslysater eller serum, og bruges især direkte til eksperimenter som CUT &RUN og CUT&Tag (en innovativ teknologi til ChIP-seq eksperimenter).
1.Produktegenskaber
- Stabil batchproduktion og bedre reproducerbarhed af resultater;
- Stabil ydeevne opbevaring
- Cellefangsteffektivitet >90 %
2. Produktoplysninger
| Kat NR. | Kat #19810ES |
| Størrelse | 1 ml/5 ml/20 ml |
| Farve | Brunlig gul |
| Perlekoncentration | 10 mg/ml |
| Solid indhold | 9-11 mg/ml |
| Perle størrelse | 1 µm |
| Kapacitet | 105 celler/µL perler |
3. Produktydelsesdata
(1)Monodispersitet
Under de samme behandlingsbetingelser og under forstørrelsen på 10×/40× var ConA-perlerne grundlæggende monodispergerede, og der blev ikke observeret nogen tydelig agglomeration i forhold til konkurrenten.
| YEASEN Råmateriale perler | Konkurrent ConA perler | YEASEN ConA perler (Kat#19810) |
Fig 5. Graf over monodispersitetsresultater
(2) Effekt af ConA perler bindende celle
Det samme antal celler blev inkuberet med perlerne i samme tid, og antallet af tilbageværende celler efter konjugering af ConA-perlerne blev automatisk detekteret under celleanalysatoren, og resultaterne viste, at YEASEN ConA-perler (Cat#19810) klarede sig bedre end konkurrentens produkter.
| Cellesuspension | Celler tilbage efter binding af konkurrerende ConA magnetiske perler | Celler tilbage efter binding af YEASEN ConA magnetiske perler |
Fig 6.Billede af ConA magnetiske perlebundne celler
(3) Cellebindingsnummer og repeterbarhed
Både 10µL YEASEN ConA Beads (Cat#19810) og 10µL Competitor ConA Beads, binder E7-niveauantal af celler, der kan sammenlignes med konkurrenten. Celleindfangning var >90 % under gentagne operationer.
Fig 7. Resultaterne af ConA-perler, der binder celleantal og indfangningshastighed
(4) Accelerationsstabilitet
Dispenser ved 1 ml/rør. Opbevaringsbetingelserne var: 4℃, 37℃ accelereret behandling i 2, 4, 7, 11 og 14 dage og -20℃ destruktionsbehandling i 1, 3, 6 og 8 dage. Resultaterne viste, at under de samme eksperimentelle forhold: celleindfangningshastigheden for produkterne opbevaret ved 4 ℃, accelereret behandling ved 37 ℃ og destruktionsbehandling ved -20 ℃ var >95 %, og CV-værdien for de tre grupper af replikater under hver behandlingstilstand var inden for 1 %, hvilket viste god reproducerbarhed.
Fig 8. Resultaterne af celleindfangningshastighed og repeterbarhedsbias af ConA-perler under forskellig temperatur og tid
Bestillingsoplysninger
| 19810ES |