Omfattende guide til organoid dyrkning

— En omfattende artikel for at uddybe din forståelse af organoider.

Introduktion til organoider

Organoider er tredimensionelle strukturer med fysiologiske funktioner, der efterligner den normale (eller syge) tilstand af indre organer eller væv, opnået gennem 3D-dyrkning uden for kroppen. I enklere vendinger er organoider tredimensionelle cellekulturer, hvor stamceller dyrkes i en matrixgel. Under påvirkning af kemiske inhibitorer/aktivatorer, cytokiner og kulturtilsætningsstoffer udvikler organoider sig til vævsstrukturer svarende til tilsvarende organer.

Karakteristika for organoider

Organoider besidder selvfornyelsesevner, der opretholder kildevævets fysiologiske struktur og funktion. De omtales ofte som "mikroorganer i en skål." Ved at udnytte stamcellernes selvfornyelse, differentiering og selvorganiserende evner kan organoider kryokonserveres til brug i biobanker og kan gennemgå ubegrænset ekspansion. Organoider er meget komplekse og, sammenlignet med 2D-celler, ligner de mere in vivo-tilstanden.

Figur 1. Organoid dyrkning af humane colon adenokarcinomceller [1]

Anvendelser af organoider

Det karakteristiske træk ved organoider er deres evne til bedre at simulere in vivo-miljøet, hvilket gør dem velegnede til molekylær- og cellulærbiologiske analyser. Ved at bygge bro mellem dyre- og celleniveauer tilbyder organoider en overlegen løsning til forskning inden for områder som tumorstudier, lægemiddelscreening, regenerativ medicin og mere. De er blevet anvendt i vid udstrækning inden for funktionel vævsinduktion, etablering af sygdomsmodeller, lægemiddelscreening, antiinflammatoriske tests, klinisk forskning og forskellige andre forskningsaspekter, hvilket viser et stort potentiale i både grundforskning og translationelle applikationer.

Efterhånden som organoide dyrkningssystemer og eksperimentelle teknikker fortsætter med at udvikle sig, er organoider blevet brugt til forskellige væv og organer, herunder tarmene (tyndtarmen/tyktarmen), mave, lever, hjerte, lunger, prostata, bugspytkirtel, nyrer, bryster, hjernelignende strukturer, nethinden, det indre øre og mere.

Organoider afledt af tumorstamceller har vist betydeligt potentiale i forståelsen af ​​mekanismerne for tumorforekomst og udvikling, screening af lægemiddelfølsomhed og fremme af præcisionsmedicin og personlig diagnose. Flere artikler fra Cell and Science indikerer, at organoider udviser høj følsomhed og specificitet til at forudsige effektiviteten af ​​kræftlægemidler. For nylig har tumororganoider vist deres rolle i at forudsige patientrespons på kræftlægemidler og hjælpe med at formulere personlige behandlingsplaner.

Forskning i udviklingsmekanismer: Organoiders differentieringsevner gør dem velegnede til at studere embryonale udviklingsprocesser og -mekanismer. Induktionsprocesserne reguleret af signalveje såsom Wnt og BMP kan bruges til at studere udviklingen af ​​organer som hjernen, bugspytkirtlen og maven [2][3][4].

Etablering af sygdomsskademodeller: Organoider induceret fra specifikke væv eller organer kan bruges til at studere modeller for specifikke sygdomme. Hold ledet af Zhao Bing og Lin Xinhua brugte humane organoid-infektionsmodeller til at studere de molekylære mekanismer for SARS-CoV-2-infektion og leverskade, hvilket gav afgørende værktøjer til at forske i virusets patogene mekanismer og efterfølgende udvikling af lægemidler [5]. Forskergruppen ledet af Deng Hongkui ved Peking University's School of Life Sciences brugte små molekyler og cytokiner til at stimulere konstruktionen af ​​en ny intestinal organoid med egenskaber af skadesregenerering - Hyper Organoid.Denne organoid kan passeres og amplificeres i en længere periode, vedligeholde genomet og fremme reparationen af ​​tyktarmsvævsskade, lindre de patologiske symptomer i en akut colitis dyremodel og mere [6].

Regenerativ medicin: Stamcelle-afledte organoider kan reparere eller erstatte beskadiget eller sygt væv for at genoprette normal vævsfunktion. De har omfattende anvendelser inden for celleterapi, herunder til andre neurodegenerative sygdomme, diabetes, hjerte-kar-sygdomme, nethindelidelser, rygmarvsskader og meget mere. Som en ny behandling inden for regenerativ medicin - DA01, ved hjælp af små molekyler som SB-431542, LDN193189, CHIR-99021, Y-27632 og Sonic Hedgehog (Shh) protein, stimulerer pluripotente stamceller til at differentiere til dopaminer. Disse neuroner transplanteres derefter ind i de skadede områder af hjernen hos patienter med Parkinsons sygdom i sene stadier, hvilket giver en ny retning og tilgang til behandlingen af ​​sygdommen [7].

Test af lægemiddeltoksicitet og -effektivitet: Organoider kan bruges til at verificere farmakotoksiciteten af ​​nye lægemidler i specifikke organer eller væv, hvilket giver datastøtte til udvikling af nye lægemidler. Brugen af ​​Hyman nyreorganoider til at verificere den renale toksicitet af Cisplatin er et eksempel [8].

Lægemiddelscreening: Organoider afledt af stamceller kan bruges til in vitro-testning af lægemiddelreaktioner, hvilket giver teoretisk støtte til lægemiddelscreening. Kolonorganoider kan bruges til at studere medicinplaner for patienter med CFTR-mutationer, og tumororganoider kan bruges til at vurdere individualiserede medicinsituationer for patienter [9].

Organoiders udviklingshistorie

Kilder til organoider

Normale organoider stammer primært fra stamceller, herunder pluripotente stamceller (PSC'er) og voksne stamceller (ASC'er). Pluripotente stamceller omfatter embryonale stamceller (ESC'er) og inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er). Sammenlignet med pluripotente stamceller har voksne stamceller fordelen af ​​at være enklere og hurtigere at modellere, men ulempen ved at konstruere organoide strukturer, der er relativt simplere. Organoide strukturer konstrueret ud fra pluripotente stamceller er mere komplekse.

Produkter brugt i Organoid dyrkning

Almindeligt brugte små molekyler i organoid kultur (resumé): Super praktisk, glem ikke at bogmærke!

❶ Y-27632 (Cat#53006ES, Cat#52604ES): En potent hæmmer af Rock, der kompetitivt hæmmer p160ROCK (Ki=140 nM) og ROCK-II (IC50=800 nM) ved ATP-konkurrence.Det hæmmer også PRK2 (IC50=600 nM). Tilsættes typisk under den første podning i pladekultur; efterfølgende medieændringer kræver muligvis ikke tilføjelse. Behandling af humane embryonale stamceller med Y-27632 (10 µM) i 1 time kan hæmme apoptose, øge kloneffektiviteten og forlænge cellepassager.

Anbefalet arbejdskoncentration: 10 μM

❷ SB-202190 (kat#53005ES): En effektiv p38 MAPK kinaseinhibitor, rettet mod p38α/β. SB202190 kan inducere differentiering af humane embryonale stamceller til hjertemuskelceller, fremme selvfornyelse af neurale stamceller og er anvendelig til dyrkning af mave-tarm- og mælkekirtelorganoider.

Anbefalet opløsningskoncentration: Opløs 10 mg i 3,018 mL DMSO for at opnå en 10 mM opløsning; opbevares ved -20 ℃.

Anbefalet arbejdskoncentration: 10 μM

❸ CHIR-99021 (Cat#53003ES): Et aminopyrimidinderivat, der virker som en GSK-3 (GSK3α/β) hæmmer. Det inducerer differentiering af humane embryonale stamceller ind i endodermen og bruges i nyre- og retinale organoidkulturer. CHIR-99021, når det bruges i kombination med andre reagenser, stimulerer somatisk celleomprogrammering til stamceller.

Anbefalet opløsningskoncentration: Opløs 5 mg i 3,58 mL DMSO for at opnå en 3 mM opløsning; opbevares ved -20 ℃.

Anbefalet arbejdskoncentration: 3 μM

❹ A 83-01 (Cat#53002ES): En Activin/NODAL/TGF-β pathway-hæmmer, der hæmmer ALK5/4/7-kinaseaktivitet. Anvendes generelt til dyrkning af lever-, prostata- og mælkekirtelorganoider. Det bruges almindeligvis til at hæmme differentieringen af ​​inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) og opretholde selvfornyelsen af ​​celler in vitro.

Anbefalet opløsningskoncentration: Opløs 5 mg i 5,93 mL DMSO for at opnå en 2 mM opløsning; opbevares ved -20 ℃. (Bemærk: Dette produkt er ustabilt i opløsning og anbefales til øjeblikkelig brug efter tilberedning.)

Anbefalet arbejdskoncentration: 2 μM

❺ Gastrin I (kat#53007ES): Gastrin er et endogent gastrointestinal peptidhormon, der stimulerer mavevægsceller til at udskille mavesyre. Det er afgørende for undersøgelser af gastrointestinale organoider. Ved dyrkning af intestinale og hepatiske organoider hjælper tilsætning af gastrin med at forlænge organoidernes overlevelsestid.

Anbefalet opløsningskoncentration: Opløs 1 mg i 2,38 mL 1% ammoniakopløsning for at opnå en 0,2 mM opløsning; opbevares ved -20 ℃.

Anbefalet arbejdskoncentration: 10 nM

❻ Nikotinamid (kat#51402ES): Nikotinamid, et B3-vitamin, deltager i forskellige enzymatiske redoxreaktioner og bruges i kulturen af ​​mave-tarm-, lever- og mælkekirtelorganoider. Nikotinamid, sammen med cytokiner og andre biokemiske reagenser, udviser anti-inflammatoriske egenskaber, fremmer differentieringen af ​​mesenkymale stamceller til insulinproducerende celler, hæmmer sirtuins aktivitet og bruges til at fremme organoiddannelse og forlænge organoid levetid.

Anbefalet opløsningskoncentration: Opløs 100 mg i 8,19 mL H2O (eller DMSO) for at opnå en 100 mM opløsning; opbevares ved -20 ℃.

Anbefalet arbejdskoncentration: 10 mM

❼ Forskolin (kat#51001ES): Forskolin kan aktivere adenylatcyclase, der almindeligvis bruges til at hæve intracellulære cAMP-niveauer. Forskolin inducerer differentiering af forskellige celletyper, aktiverer PXR og FXR og har antiblodpladeaggregation og antihypertensive virkninger. Ved dyrkning af leverorganoider er det vigtigt at tilføje dette stof.

Anbefalet arbejdskoncentration: 1-10 μM

❽ Prostaglandin E2 (Cat#60810ES): Prostaglandin E2 (PGE2) regulerer mange fysiologiske systemer og medierer celleproliferation og -differentiering.Det er nødvendigt ved dyrkning af lever- og prostataorganoider og er forbundet med afslapning af glatte muskler, betændelse, reproduktion, regulering af søvncyklus og maveslimhindeintegritet.

Anbefalet opløsningskoncentration: Opløs 1 mg i 0,28 mL DMSO for at opnå en 10 mM opløsning; opbevares ved -20 ℃.

Anbefalet arbejdskoncentration: 500 nM

❾ N-acetyl-L-Cystein (Cat#50303ES): N-acetyl-L-cystein (NAC) er en forløber for antioxidanten glutathion med antioxidant- og ROS-hæmmende virkninger. Det hæmmer neuronal celle apoptose og er påkrævet i dyrkningsprocessen af ​​de fleste organoider.

Anbefalet opløsningskoncentration: Opløs 2 g i 24,51 mL H2O (eller DMSO) for at opnå en 500 mM opløsning; opbevares ved -20 ℃.

Anbefalet arbejdskoncentration: 1 mM

Relateret produktinformation

Referencer:

[1] Sato T, Stange DE, et al.Langsigtet udvidelse af epitelorganoider fra human colon, adenom, adenocarcinom og Barretts epitel. Gastroenterologi. 2011 Nov;141(5):1762-72. doi: 10.1053/j.gastro.2011.07.050. Epub 2011 2. sep. PMID: 21889923.

[2] Lancaster MA, Renner M, et al. Cerebrale organoider modellerer menneskelig hjerneudvikling og mikrocefali. Natur. 2013.501(7467):373-379. http://dx.doi.org/10.1038/nature12517.

[3] Greggio C, et al. Kunstige tredimensionelle nicher dekonstruerer bugspytkirtlens udvikling in vitro. Udvikling. 2013.140(21):4452-4462. http://dx.doi.org/10.1242/dev.096628.

[4] McCracken KW, et al. Modellering af menneskelig udvikling og sygdom i pluripotente stamcelle-afledte gastriske organoider. Natur. 2014.516(7531):400-404. http://dx.doi.org/10.1038/nature13863.

[5] Zhao B, Ni C, et al. Rekapitulation af SARS-CoV-2-infektion og cholangiocytbeskadigelse med humane leverorganoider. Proteincelle. oktober 2020; 11(10):771-775. doi: 10.1007/s13238-020-00718-6. PMID: 32303993; PMCID: PMC7164704.

[6] Qu M, Xiong L, et al. Etablering af intestinale organoide kulturer, der modellerer skadesassocieret epitelregenerering. Cell Res. Marts 2021;31(3):259-271. doi: 10.1038/s41422-020-00453-x. Epub 2021 8. jan. PMID: 33420425; PMCID: PMC8027647.

[7] BlueRock Therapeutics annoncerer første patient doseret med DA01 i fase 1-studie i patienter med avanceret Parkinsons sygdom. BlueRock Therapeutics pressemeddelelse: 8. juni 2021.

[8] Takasato M, Er PX, et al. Nyreorganoider fra humane iPS-celler indeholder flere afstamninger og modellerer human nefrogenese. Natur. 2015.526(7574):564-568. http://dx.doi.org/10.1038/nature15695.

[9] Spence JR, Mayhew CN, et al. Direkte differentiering af humane pluripotente stamceller til tarmvæv in vitro. Natur. 2011.470(7332):105-109. http://dx.doi.org/10.1038/nature09691.