HEK293-værtscelle-residual DNA-fragmentanalysesættet er designet til kvantitativ analyse af HEK293-rest-DNA-fragmenter af forskellig længde i mellemprodukter, halvfabrikata og slutprodukter af biologiske præparater. Dette kit anvender qPCR-fluorescensprobeprincippet til specifikt og hurtigt at detektere HEK293 DNA-rester både under og over 200 basepar med en kvantificeringsgrænse så lav som 10 fg/μL. Det inkluderer også HEK293 DNA Control (DNA kvantitativ reference). Dette kit kan bruges sammen med virksomhedens magnetiske perle-baserede rest-DNA prøveforberedelseskit (Kat #18461ES/18462ES).

Produktinformation

Komponent

Opbevaring og forsendelse:

1. Alle komponenter sendes på tøris og skal opbevares ved -25°C til -15°C ved modtagelse. Holdbarheden er 2 år. Komponent A og B1, B2, B3 og B4 skal opbevares beskyttet mod lys.

2. Ved modtagelse skal du kontrollere, at alle 7 komponenter er til stede, og straks opbevare dem ved de anbefalede temperaturer.

Forholdsregler:

1. Dette produkt er kun beregnet til forskningsformål.

2. Af sikkerheds- og sundhedsmæssige årsager bedes du bære laboratoriefrakker og engangshandsker under drift.

3. Før du bruger dette reagens, skal du læse brugsanvisningen omhyggeligt. Eksperimenter bør udføres efter standardprocedurer, herunder prøvehåndtering, forberedelse af reaktionsblandinger og pipettering.

4. Hver komponent skal blandes grundigt ved forsigtig omrystning og kortvarigt centrifugeres før brug.

Kompatible instrumenter:

Herunder, men ikke begrænset til, følgende instrumenter: Thermo Scientific: ABI 7500, ABI Quant Studio 5, ABI Step OnePlus, Bio-Rad: CFX96 optisk modul, Shanghai Hongshi Medical Technology: SLAN-96S

Brugsanvisning

1. Fortynding af HEK293 DNA-kontrolkvantitativ reference og forberedelse af standardkurver

HEK293 Fragment Analysis Kit inkluderer fire amplifikationsfragmenter af forskellig længde: 82 bp, 133 bp, 227 bp og 515 bp. Når du etablerer standardkurver, skal du opsætte separate kurver for hvert amplifikationsfragment og beregne deres resterende mængder og relative fordelinger baseret på de tilsvarende standardkurver.

Brug den medfølgende DNA-fortyndingsbuffer i sættet til at udføre en gradientfortynding af HEK293 DNA-kontrolkvantitative reference. Fortyndingskoncentrationerne skal være: 3 ng/μL, 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL og 30 fg/μL.

Detaljerne er som følger

1). Placer HEK293 DNA Control og DNA Dilution Buffer fra sættet på is for at tø op. Efter fuldstændig optøning, vortex forsigtigt for at blande og centrifuger kortvarigt (10 sekunder) for at opsamle opløsningen i bunden af ​​røret.

2). Forbered seks rene 1,5 mL centrifugerør og mærke dem som Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 og Std5.

3). I røret mærket Std0 tilsættes 90 μL DNA-fortyndingsbuffer og 10 μL HEK293 DNA Control for at opnå en koncentration på 3 ng/μL. Vortex forsigtigt for at blande og centrifuger kortvarigt (10 sekunder). Denne koncentration kan uddeles i alikvoter og opbevares ved -20°C til kortvarig brug (op til 3 måneder). Undgå gentagne fryse-tø-cyklusser.

4). I rørene mærket Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 og Std5 tilsættes først 90 μL DNA-fortyndingsbuffer til hver. Hvert fortyndingstrin skal blandes forsigtigt og centrifugeres kort for at sikre ensartethed. Udfør derefter gradient fortyndinger som følger:

Tabel 1: Standard gradientfortynding

* For hver koncentration udføres 3 replikater. Dette reagens kan teste inden for et lineært område på 300 pg/μL til 30 fg/μL. Om nødvendigt kan det lineære område udvides eller indsnævres passende.

** For at reducere gentagne fryse-tø-cyklusser og undgå kontaminering anbefales det at alikvotere og opbevare DNA-kvantificeringen standard ved -20°C til første brug.

*** Ubrugt, optøet DNA-fortynding kan opbevares ved 2-8°C i op til 7 dage. Hvis den ikke bruges i længere tid, skal den opbevares ved -20°C.

**** For at sikre fuldstændig blanding af skabelonen, ryst forsigtigt hver gradientfortynding i ca. 1 minut.

2. Forberedelse af testprøve (TS)

Forbered testprøven TS i henhold til eksperimentopsætningen som følger:

1) Tag 100 μL af testprøven og tilsæt den til et 1,5 mL rent centrifugerør. Mærk det som TS, udfør prøveforbehandling og klargør to purify den testprøve.

2) For at opfylde kravet om at analysere fire forskellige forlængelseslængder samtidigt, bør mængden af ​​forbehandlet testprøve være ≥120 μL. Derfor anbefales det at forberede 2 rør af hver prøve til forbehandling, og efter ekstraktion blandes dem sammen til brug.

3. Forberedelse af negativ ekstraktionskontrol (NCS)

Forbered den negative ekstraktionskontrol NCS i henhold til eksperimentopsætningen som følger:

1) Tag 100 μL af prøvematrixopløsningen (eller DNA-fortynding buffer) og tilsæt det til et 1,5 ml rent centrifugerør. Mærk det som NCS.

2) Udfør prøveforbehandlingen af ​​den negative kontrol NCS sammen med partiet af testprøver og klargør den oprensede negative kontrol NCS-opløsning.

3) For at opfylde kravet om at analysere fire forskellige forlængelseslængder samtidigt, bør mængden af ​​forbehandlet NCS-prøve være ≥120 μL. Derfor anbefales det at forberede 2 rør af hver NCS-prøve til forbehandling, og efter ekstraktion blandes dem sammen til brug.

4. Forberedelse af No Template Control (NTC)

Forbered NTC'en uden skabelonkontrol i henhold til eksperimentopsætningen som følger:

1) Ingen skabelonkontrol (NTC) kræver ikke prøve forbehandling, og kan fremstilles fra stadiet med påvisning af resterende DNA-indhold ved hjælp af qPCR.

2) For hvert rør eller brønd består NTC-prøven af ​​20 μL blanding (dvs. 15 μL HEK293 qPCR Mix + 5 μL tilsvarende HEK293 Primer & Probe Mix) + 10 μL DNA-fortyndingsbuffer. Det anbefales at forberede nok til 3 replikatbrønde.

5. qPCR reaktionssystem

Tabel 2. Reaktionssystem for 82 bp fragment

Tabel 3. Reaktionssystem for 133 bp fragment

Tabel 4. Reaktionssystem for 227 bp fragment

Tabel 5. Reaktionssystem for 515 bp fragment

* For at beregne den samlede mængde Mix, der kræves til denne reaktion baseret på antallet af brønde:

Bland = (Antal reaktionsbrønde + 2) × (15 + 5) μL (for at tage højde for de 2 brøndes tab). Typisk forberedes 3 replikatbrønde for hver prøve.

** Antal reaktionsbrønde = (5 koncentrationsgradient standardkurvebrønde + 1 ingen skabelonkontrol (NTC) + 1 negativ kontrolopløsning (NCS) + N testprøver (TS)) × 3.

NTC (ingen skabelonkontrol): DNA-fortyndingsbuffer

NCS (negativ kontrolopløsning): Prøvematrixopløsning eller DNA-fortyndingsbuffer efter prøve præ-behandling for at opnå den rensede opløsning, som er NCS.

TS (Test Sample): Prøven, der skal testes.

*** Efter dispensering af prøverne og forsegling af rørene, centrifugeres kort ved lav hastighed (10 sek.) for at opsamle væsken fra rørets vægge til bunden. Derefter vortex i mindst 5 sekunder for at blande grundigt. Udfør derefter endnu en lavhastighedscentrifugering (10 sek.). Hvis der er bobler, skal du sørge for at fjerne dem.

Tabel 6: Referencepladelayout

Dette eksempel vises qPCR-detektionsproceduren til analyse af amplifikationsfragmenterne af resterende HEK293-DNA.Testprøverne inkluderer: 5 koncentrationsgradienter af HEK293 DNA-standardkurve, 1 testprøve (TS), 1 negativ kontrolopløsning (NCS) og 1 kontrol uden skabelon (NTC). Det anbefales at køre 3 replikatbrønde for hver prøve.

6. Amplifikationsprogramparametre (Ttre- trin metode) (Eksempel ved brug af ABI 7500 qPCR-instrument, softwareversion 2.0)**

1) Opret et nyt tomt program og vælg "Absolut kvantificering" som detektionsskabelon.

2) For de fire forskellige amplifikationsfragmentlængder skal du oprette nye detektionsprober og navngive dem "HEK293-82", "HEK293-133", "HEK293-227", og "HEK293-515". Vælg reporter-fluoroforen som "FAM" og quencher-fluoroforen som "ingen". Indstil referencefarvestoffet til detektion som "ROX" (referencefarvestoffet kan tilføjes eller ej afhængigt af instrumentmodellen og andre faktorer).

3) I panelet "Tildel mål(er) til de valgte brønde" skal du indstille feltet "Opgave" for standardkurvebrøndene som "Standard", og tildele de tilsvarende værdier i feltet "Mængde" som "300000", "30000", "3000", "300", "30" (repræsenterer DNA-koncentrationen pr. brønd, i fg/μL). Navngiv brøndene i feltet "Sample Name" som "300 pg/μL", "30 pg/μL", "3 pg/μL", "300 fg/μL", "30 fg/μL". For NTC-brøndene skal du indstille "Task" til "NTC". For NCS- og TS-brøndene, indstil "Opgaven" til "Ukendt", og navngiv brøndene "NCS" og "TS" i feltet "Sample Name". Efter indstilling af disse parametre skal du klikke på "Start Run" for at starte instrumentkørslen.

4) Amplifikationsprogramindstillinger: Indstil tre-trins amplifikationsprogrammet med et reaktionsvolumen på 30 μL.

Tabel7. PCR procedure

7. qPCR resultatanalyse

1) I panelet "Analyse" under "Amplification Plot" vil systemet automatisk indstille "Threshold". Nogle gange er standard "Threshold" for tæt på basislinjen, hvilket forårsager betydelig Ct-variation mellem replikater. Du kan manuelt justere "Threshold" til en passende position og klikke på "Analyze". På dette tidspunkt kan du foreløbigt tjekke amplifikationskurverne i "Multicomponent Plot" for at se, om de er normale.

2) I panelet "Analyse" under "Standardkurve" kan du aflæse standardkurvens R², forstærkningseffektivitet (Eff%), hældning og intercept. For en normal standardkurve: R² > 0,99, amplifikationseffektivitet (90% ≤ Eff% ≤ 110%) og hældning mellem -3,6 og -3,1.

3) I panelet "Analyse" under "Se brøndtabel" kan du læse kolonnen "Mængde" for kontrol uden skabelon (NTC), negativ kontrol (NCS) og testprøver (TS), med enheden i fg/μL. Enhederne kan konverteres senere i rapporten.

4) Parameterindstillingerne for resultatanalyse bør afhænge af den specifikke instrumentmodel og softwareversion. Normalt kan instrumentet automatisk fortolke resultaterne.

5) Ct-værdien af ​​den negative kontrol (NCS) bør være større end den gennemsnitlige Ct-værdi for standardkurvens laveste koncentration.

6) Resultatet af no-template-kontrollen (NTC) skal være "Ubestemt" eller have en Ct-værdi ≥ 32.

Dokument

Manuel