1 El principio de acción de la genetomicina

La genetomicina (geneticina, G418) es un antibiótico aminoglucósido que inhibe la síntesis de proteínas al bloquear la extensión de la cadena peptídica mediante la unión a los ribosomas 70S y 80S en células procariotas y eucariotas. Este mecanismo es tóxico para las bacterias, levaduras, plantas y células de mamíferos. Cuando las células se transfectaron con éxito y se integraron con un gen de resistencia a la neomicina (como el gen neo), la aminoglucósido fosfotransferasa codificada por el gen (APH (3) II) pudo modificar covalentemente el G418 para inactivarlo, confiriendo así resistencia a las células cultivadas en un medio selectivo que contenía G418.

En las pruebas genéticas moleculares, G418 es uno de los métodos comúnmente utilizados para la transfección estable.

2 La aplicación de la genomicina

2.1 Detección de líneas celulares transfectadas estables

• Se utilizó G418 para detectar células que contienen genes de resistencia (por ejemplo, genes neo) al inhibir la síntesis de proteínas. La aminoglucósido fosfotransferasa codificada por el gen de resistencia inactiva G418, lo que confiere resistencia celular a G418. Por lo general, el rango de detección de células de mamíferos es de 200 a 2000 μg/mL, con la concentración de trabajo más comúnmente utilizada de 100 a 700 μg/mL. Cuando las células vegetales son de 10 a 100 μg/mL y las células de levadura son de 500 a 1000 μg/mL, las siguientes son las concentraciones utilizadas para algunos tipos de células utilizando G418 como referencia.

Celúla	Solicitud	Concentración de activación de la genomicina (μg/mL)	Obras citadas
Especies de Mucor	a) Cultivado en medio de crecimiento b) Cultivado en bacterias liofilizadas	a) 10 μg/ml b) 30 μg/ml	Hirth y col. Actas de la Academia Nacional de Ciencias, v. 79, 7356-7360 (1982).
Mamífero	a) Para la detección b) Para mantener el crecimiento	a) 400-1000 μg/ml b) 200 μg/mL	Canaani y Berg, Actas de la Academia Nacional de Ciencias, v. 79, 5166-5170 (1982).
Planta	a) Para la detección b) Para mantener el crecimiento	a) 25-50 μg/ml b) 10 μg/ml	Ursic, et. al., Bioquímica, Biofísica, Res. Comm., v. 101:3, 1031-1037 (1981).
Levadura	a) Para la detección b) Para mantener el crecimiento	a) 500 μg/mL b) 125-200 μg/ml	Jiménez y Davies, Naturaleza, v. 287, 869-871 (1980).
Bacteria	Para la detección	16 μg/ml	Waitz y col. Agentes antimicrobianos, quimioterapéuticos v. 6:5, 579-581 (1974).

2.2 Eliminación de genes y transferencia de genes

• En la eliminación de genes, el G418 se puede utilizar para seleccionar células que eliminen con éxito el gen objetivo. En la transferencia de genes, el G418 facilita la integración de genes extraños en el genoma de las células huésped.

2.3 Selección de resistencia en cultivos celulares

• Durante el cultivo celular, se utiliza G418 para detectar células resistentes al antibiótico, que a menudo portan genes de resistencia específicos.

3 Procedimientos experimentales relevantes para la genomicina

3.1 Preparación de la solución madre de G418 (50 mg/ml, concentración activa)

1) Conversión de unidades de actividad

Convierta utilizando la fórmula: (1000/A0) × A1 = A2, donde A0 es la potencia de G418, que varía según el lote. Consulte el informe de control de calidad del lote correspondiente o la etiqueta del frasco. A1 es la concentración activa deseada de G418 que se preparará. A2 es la concentración real de polvo por volumen que se pesará.

Por ejemplo, si el lote de G418 tiene una potencia de 750 U/mg y desea preparar una concentración activa de 50 mg/mL, entonces la concentración de polvo real a preparar es 1000/750 × 50 mg/mL = 66,67 mg/mL.

Si se preparan 10 ml de solución madre de G418 (concentración activa, 50 mg/ml), se requieren 666,7 mg de polvo.

• Esterilización y almacenamiento

Según el peso real del polvo obtenido de la conversión anterior, agréguelo a 10 ml de agua desionizada estéril para disolverlo por completo.

En primer lugar, humedezca previamente un filtro de jeringa de 0,22 μm con 5 ml de agua desionizada estéril y elimine toda el agua. A continuación, filtre con este filtro para esterilizar y divida en alícuotas pequeñas para un solo uso (p. ej., 1 ml) y consérvelo a -20 °C para que se mantenga estable durante 1 año.

3.2 Establecimiento de la curva de muerte

1) Día uno: Coloque las células no transformadas a una densidad celular del 20-25 % en placas de cultivo adecuadas e incube durante la noche a 37 °C, CO₂.

2) Establecer un gradiente de concentración dentro de un rango adecuado según el tipo de célula, seleccionando al menos 6 concentraciones (G418 es más activo contra las células en la fase de división, por lo que las células deben cultivarse durante un período antes de agregar G418), por ejemplo, para células de mamíferos, establecer 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL.

3) Día dos: Retirar el medio de cultivo antiguo y reemplazarlo con medio recién preparado que contenga la concentración correspondiente del fármaco, con tres réplicas para cada concentración.

4) Reemplazar con medio nuevo que contenga fármaco cada 3-4 días.

5) Realice recuentos de células vivas a intervalos fijos (por ejemplo, cada 2 días) para determinar la concentración adecuada que evite el crecimiento de células no transfectadas. Seleccione la concentración más baja que pueda matar la mayoría de las células en el número ideal de días (generalmente de 7 a 10 días) como concentración de trabajo para la detección de líneas celulares transfectadas estables.

3.3 Detección de células transfectadas estables

• La Geneticina G418 (60220ES) proporcionada por Yisheng Biotech tiene una eficacia de ≥720 U/mg, una pureza de ~98% y estabilidad del lote, con un precio de casi un tercio de los productos G418 de otras compañías.
• El medio de cribado que contenía los fármacos se reemplazó cada 3-4 días.
• Se observó y evaluó la formación de clones celulares (colonias) después de 7 días de selección. Las colonias pueden tardar una semana o más en formarse, según el tipo de célula huésped, la transfección y la eficacia de la detección.
• Se seleccionaron de 5 a 10 clones resistentes y se transfirieron a placas de cultivo celular de 35 mm y se mantuvieron con un medio de detección que contenía fármaco durante 7 días.
• Después de cambiar el medio de cultivo normal.

4 Recomendación de producto

La Geneticina G418 (60220ES) proporcionado por Yeasen Biotech tiene una eficacia de ≥720 U/mg, una pureza de ~98% y estabilidad de lote, con un precio de casi un tercio del de los productos G418 de otras compañías.

Especificación	S*	Yo*	Yeasen	Ventaja de Yeasen
Contenido (HPLC)	/	/	~98%	Alta pureza
Potencia (U/mg)	≥720 µg/mg	707-721 µg/mg	≥720 µg/mg	Alta efectividad
Precio ($/5 g)	~1000	~1000	~200	Baratura

5 Caso experimental

En E. coli, G69 y G99 fueron dos lotes diferentes; las concentraciones de genomicina fueron 8 mg/L, 12 mg/L y 16 mg/L, respectivamente, y la concentración mínima efectiva fue 16 mg/L, lo que inhibió completamente el crecimiento de bacterias diversas.