¿Qué es la aureobasidina A?
La aureobasidina A (AbA) es un antibiótico peptídico cíclico aislado del hongo filamentoso Aureobasidium pullulans No. R106, que tiene fuertes propiedades antifúngicas y puede ser tóxico para la levadura en bajas concentraciones (0,1-0,5 μg/mL). El mecanismo de acción de AbA es a través de la inhibición de la actividad de la inositol fosforilceramida sintasa (IPC sintasa), una enzima codificada por el gen AUR1 en la levadura, bloqueando la síntesis de ceramida a fosfolípidos de inositol, lo que conduce a una deficiencia de esfingolípidos, ruptura de la membrana celular y, por lo tanto, a la muerte de la cepa. Las especies de hongos sensibles a AbA incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans y A. niger.
Figura 1 Fórmula estructural de AbA, CAS#127785-64-2
Las investigaciones han demostrado que el gen AUR1 de Saccharomyces cerevisiae y el gen AURA de Aspergillus nidulans son homólogos y ambos codifican la IPC sintasa. Por lo tanto, las mutaciones en estos dos genes pueden conferir una fuerte resistencia a AbA a las cepas, como el gen mutado AUR1-C. AbA es muy adecuado como marcador de selección de fármacos para la detección de clones positivos y no requiere optimización de las condiciones, con un fondo muy bajo. La resistencia a AbA también es un indicador ideal para estudios de híbridos simples/dobles de levadura y es compatible con los sistemas híbridos de levadura que presentan la resistencia correspondiente.
¿Qué es el sistema híbrido simple/doble de levadura?
El sistema de doble híbrido de levadura (ensayo de doble híbrido de levadura) fue creado por Fields y Song y otros basándose en las características de la regulación transcripcional eucariota. Puede analizar de forma rápida y directa las interacciones entre proteínas conocidas y se utiliza ampliamente en el estudio de las interacciones antígeno-anticuerpo, el descubrimiento de nuevas proteínas y nuevas funciones proteicas, la detección de dianas farmacológicas y el establecimiento de mapas de enlaces proteicos genómicos. El principio del doble híbrido de levadura es que el activador transcripcional de los eucariotas contiene dos dominios estructurales diferentes: el dominio de unión al ADN (dominio de unión al ADN, DNA-BD) y el dominio de activación de la transcripción del ADN (dominio de activación, AD), que pueden separarse de forma independiente sin afectar la función de cada uno. BD y AD por sí solos no pueden activar la respuesta transcripcional, solo cuando los dos están lo suficientemente cerca espacialmente, exhiben la actividad de un activador transcripcional completo, lo que permite que se transcriba el gen aguas abajo. Al construir plásmidos de fusión de las dos proteínas en estudio (proteína X y proteína Y) con dominios BD y AD respectivamente y expresarlos en la misma célula de levadura, si no hay interacción entre las dos proteínas, el gen reportero no se transcribirá; si las dos proteínas interactúan, los dominios BD y AD estarán espacialmente cerca, por lo que el gen reportero se transcribe.
Figura 2 Diagrama de principio de la doble hibridación de levadura [1]
La tecnología de un híbrido de levadura es una herramienta para estudiar las interacciones entre ácidos nucleicos y proteínas, desarrollada sobre la base del doble híbrido de levadura, y se utiliza ampliamente para estudiar la regulación de la expresión de genes en células eucariotas, como identificar si existe una interacción entre ADN conocido y proteínas conocidas; aislar nuevas proteínas que se unan al elemento regulador cis objetivo u otros sitios de unión de ADN cortos; localizar con precisión los sitios de unión de ADN que se ha demostrado que interactúan y analizar los dominios de unión de ADN de las proteínas. Su principio básico es construir el elemento que actúa en cis conocido aguas arriba del promotor más básico (promotor mínimo, Pmin) y conectar el gen reportero aguas abajo de Pmin. El ADNc que codifica el factor de transcripción que se va a probar se fusiona con el vector de expresión del dominio AD de levadura y se introduce en células de levadura.Si el producto de este gen puede unirse al elemento que actúa en cis, puede activar el promotor Pmin, permitiendo que se exprese el gen reportero.
Figura 3 Diagrama de principio del híbrido único de levadura [2]
Para estudios de híbridos simples/dobles de levadura, Yeasen ofrece productos 60231ES Aureobasidina A (AbA), una solución de AbA disuelta en metanol con una pureza de ≥ 97% y una concentración de 1 mg/mL. Yeasen recomienda una concentración inhibitoria de AbA de 100-1000 ng/mL en experimentos de híbridos simples/dobles de levadura, y la concentración de trabajo específica depende de la sensibilidad de las células hospedadoras (consulte la siguiente tabla, Concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) de AbA para varias cepas de levadura).
| Btensión arterial | micrófono (norteg/ml) | |
| S. cerevisiae | ATCC9763 (diploide) | 200-400 |
| SH3328 (haploide) | 100 | |
| Levadura de sake (diploide) | 100-200 | |
| Levadura de shochu (diploide) | 100 | |
| Levadura de cerveza (triploide o tetraploide) | 100 | |
| Levadura de panadero (diploide) | 200-400 | |
| Pombe esquizofrénico | JY-745 (monoploide) | 100 |
| C. albicans | TIMM-0136 (diploide) | 40 |
| C. tropicalis | TIMM-0324 (diploide) | 80 |
Caso de aplicación
Para estudiar el sitio de unión de la proteína GmWRKY31 en el promotor del gen GmSAGT1, en el experimento de monohíbrido en levadura, la secuencia de ADN diana se insertó en el vector pBait-AbAi que contiene el gen reportero de uracilo Ura3, ubicado aguas arriba del gen AUR1-C. Después de la transformación de la levadura con el plásmido correspondiente, se suspendió en una solución de NaCl al 0,9% y se ajustó la DO600 a 0,005. Posteriormente, se extendieron 100 μL de la muestra en placas que contenían 500 ng/mL de AbA, se invirtieron y se cultivaron a 30℃ durante 3-5 días.[3].
Figura 3 Interacción de la proteína GmWRKY31 con cepas de levadura que contienen fragmentos F16, F20, F73, delF16, delF20 o delF73.
Artículos publicados con nuestros reactivos
[1] Shunan Zhang, Yuyi Zhang, Kangning Li, et al. El nitrógeno media el tiempo de floración y la eficiencia del uso del nitrógeno a través de reguladores florales en el arroz, Current Biology, volumen 31, número 4, 2021, https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.10.095. (SI:10.834)
[2] Jiaying Kuang, Yingchun Xu, Yidan Liu, et al. Una red reguladora centrada en NnSnRK1 de la terminación temprana de la floración inducida por la sombra en el loto, Botánica ambiental y experimental, volumen 221, 2024, 105725. https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2024.105725. (SI:5.7)
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Documentación de referencia
[1] Paiano A, et al. Ensayo de dos híbridos de levadura para identificar proteínas interactuantes.Curr Protoc Protein Sci. 2019 feb;95(1):e70.
[2] John S, et al. Ensayos de un híbrido de levadura: una perspectiva histórica y técnica. Métodos. Agosto de 2012;57(4): 441-447.
[3] Dong H, et al. Análisis del transcriptoma de los TF WRKY de soja en respuesta a la infección por Peronospora manshurica. Genomics. Diciembre de 2019;111(6):1412-1422.