1 APrincipio de ficción

La higromicina B es un antibiótico aminoglucósido producido por el metabolismo de Streptomyces hygroscopicus, que inhibe la síntesis de proteínas al interrumpir la translocación y promover la lectura errónea de los ribosomas 80S, matando así las células procariotas y eucariotas.

En la actualidad, se utiliza comúnmente para examinar y mantener células procariotas o eucariotas que contienen el gen de resistencia a la higromicina.

2 Aplicación

2.1 Seleccionar y mantener cultivos de células procariotas o eucariotas (células vegetales y células de mamíferos) transfectadas de forma estable con Hph+Vectores

La higromicina B gen de resistencia (hyg o hph) derivado de Escherichia coli. codifica la higromicina B fosfotransferasa, que convierte la higromicina B en un producto fosforilado biológicamente inactivo, desintoxicando así. En vista de este principio, la higromicina B es un marcador seleccionable muy útil para examinar y mantener células procariotas o eucariotas cultivadas transfectadas con éxito con el gen de resistencia a la higromicina.

2.2 Debido a la diferencia en el modo de acción, la higromicina B se utiliza a menudo en combinación con genericina G418, bleomicina y blasticidinas para examinar líneas celulares transfectadas de forma estable con dos vectores diferentes.

La higromicina B tiene un modo de acción diferente al G418 (Cat#60220ES), Bleomicina (Cat#60257ES) y blasticidinas (Cat#60218ES), por lo que es muy adecuado para su uso en combinación con otros antibióticos selectivos en experimentos de doble selección.

2.3 Agente antiviral
2.4 Como antihelmíntico, se añade al alimento para animales y se crían.
2.5 Detección de células transfectadas de forma estable

La concentración de trabajo de higromicina B utilizada para detectar transfectantes estables varía según el tipo de célula, el medio, las condiciones de crecimiento y la tasa metabólica celular. La concentración recomendada es de 50-1000 μg/mL. Para el primer uso del sistema experimental, se recomienda que la concentración óptima de detección se determine estableciendo una curva de eliminación, es decir, una curva dosis-respuesta. En general, 50-500 μg/mL para células de mamíferos; 20-200 μg/mL para bacterias/células vegetales; 200-1000 μg/mL para hongos.

3 Protocolo

3.1 Preparación de solución de almacenamiento (50 mg/mL)

Pesar 0,5 g de higromicina B y añadir 10 ml de solución 1×PBS, pH 7,4. Una vez disuelta por completo, filtrar con un filtro de 0,22 μm para esterilizar. Dividir en alícuotas la solución esterilizada y almacenar a -20 ℃.

3.2 Concentración de detección de uso común

La concentración de trabajo de higromicina B para el cribado de cepas estables varía según el tipo de célula, el medio de cultivo, las condiciones de crecimiento y la tasa metabólica celular. Se recomienda establecer una curva de muerte (curva dosis-respuesta) para determinar la concentración óptima de cribado por primera vez. Generalmente, células de mamíferos: 50-500 μg/mL; células bacterianas/vegetales: 20-200 μg/mL; hongos: 300-1000 μg/mL.

3.3 Establecimiento de la curva de matanza

【Nota】Para examinar líneas celulares estables, es necesario determinar la concentración mínima de antibióticos capaces de matar células hospedadoras no transfectadas. Esto se puede lograr estableciendo una curva de muerte (curva dosis-respuesta). Se deben organizar al menos cinco concentraciones.

1) Día 1: Las células no transformadas se colocan en una placa de cultivo adecuada a una densidad celular del 20-25% y se cultivan durante la noche.【Nota】La cantidad de células de inoculación se puede aumentar para las células que requieren mayor densidad para detectar vitalidad.

2) Ajuste el gradiente de concentración dentro del rango apropiado según el tipo de célula. Las células de mamífero pueden ajustarse a 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μg/mL. Diluya la solución de higromicina B 1:10 con agua desionizada o tampón PBS a 5 mg/mL. Luego diluya la solución a la concentración de trabajo correspondiente según la siguiente tabla.

Concentración final (μg/mL)	Volumen medio (mL)	Volumen de adición de 5 mg/mL de higromicina B (mL)
50	9.9	0,1
100	9.8	0,2
250	9.5	0,5
500	9.0	1.0
750	8.5	1.5
1000	8.0	2.0

3) Día 2: Reemplazar con un medio recién preparado que contenga la concentración correspondiente del fármaco. Realizar tres muestras paralelas para cada concentración.

4) Reemplazar con medio fresco que contenga medicamento cada 3-4 días.

5) Los recuentos de células vivas se realizan en un ciclo fijo (por ejemplo, cada 2 días) para determinar la concentración adecuada para evitar el crecimiento de células no transfectadas. Elija la concentración mínima que mate a la mayoría de las células en un número ideal de días (normalmente, entre 7 y 10 días), como concentración de trabajo para la detección de líneas celulares estables.

3.4 Cribado de células transfectadas estables

1) 48 h después de la transfección, las células se subcultivaron en un medio de cribado que contenía higromicina B en la concentración adecuada (directa o diluida). 【Nota】Los antibióticos funcionan mejor en células que se dividen activamente. Si las células son demasiado densas, el antibiótico no las matará. Divida las células de modo que no tengan más del 25 % de confluencia.

2) Cambie el medio de cribado cada 3-4 días.

3) Medir la formación de colonias celulares después de 7 días de detección. La formación de colonias puede tardar una semana o más, dependiendo del tipo de célula huésped, la transfección y la eficacia de la detección.

4) Seleccionar de 5 a 10 clones resistentes y transferirlos a placas de cultivo celular de 35 mm y cultivarlos en un medio de detección que contenga el fármaco durante 7 días.

5) Reemplazar con medio fresco sin drogas para el cultivo.

4 Propiedades

La higromicina B es un polvo de color blanco a marrón amarillento con un olor especial, fácilmente soluble en agua, metanol, etanol, etc., y forma fácilmente sales con muchos ácidos orgánicos e inorgánicos.

5 Almacenamiento del producto

La solución se puede almacenar directamente a 2~8 ℃ y puede conservarse durante más de 6 meses.

6 Precaución

1)Las células transfectadas con el gen hph son resistentes a la higromicina y expresan el gen de forma estable o temporal.

2)El gen de resistencia a la higromicina B (hyg o hph) se encontró en otras cepas, incluidas Streptomyces hygroscopicus y Klebsiella pneumoniae, además de E. Coli.

7 Recomendación de productos

Yeasen proporciona Higromicina B en dos formas, polvo (1 g/10 g, Cat#60225ES) y solución (50 mg/mL, Cat#60224ES).

Nombre del producto	Gato#	Especificación
Higromicina B (50 mg/ml)	60224ES03	1 g (20 ml)
	60224ES10	10 x 1 g (20 ml)
Higromicina B	60225ES03	1 gramo
	60225ES10	10 g

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