La apoptosis se refiere en general a un tipo de muerte celular programada que se produce mediante la regulación de los genes intracelulares y sus productos durante el desarrollo de las células o bajo la acción de algunos factores. La apoptosis desempeña un papel importante en el desarrollo embrionario y la morfogénesis, la estabilidad de las poblaciones celulares normales en los tejidos, la defensa del cuerpo y la respuesta inmunitaria, el daño celular y el envejecimiento causados ​​por enfermedades o intoxicaciones, y la aparición y progresión de tumores, y tiene un potencial significado terapéutico.

Los eventos en la vía apoptótica ocurren en una secuencia de tiempo, es decir, los eventos ocurren en secuencia y eventualmente conducen a la aparición de cuerpos apoptóticos, con la ocurrencia de la apoptosis.

Sus características típicas son las siguientes:

1. Apoptosis temprana: cambios en la estructura de la membrana celular, eversión de la fosfatidilserina;

2. Apoptosis en etapa temprana y media: la densidad del citoplasma aumentó, el potencial de membrana mitocondrial desapareció, la permeabilidad cambió y el citocromo C se liberó al citoplasma;

3. Apoptosis tardía: transducción de señales de apoptosis;

4. Apoptosis tardía: ADN degradado a un tamaño de fragmento de 180~200 pb.

Figura 1: Ocurrencia y detección de eventos secuenciales en la vía de la apoptosis

1. Apoptosis temprana: Anexina-V/PI Doble tinción (detección de PS en la membrana extracelular)

En las células vivas normales, la fosfatidilserina (PS) se encuentra en el lado interno de la membrana celular. Cuando se produce la apoptosis, la membrana celular cambia y la PS pasa de la superficie interna de la membrana celular a la superficie externa de la membrana celular. La anexina-V es una proteína de unión a fosfolípidos dependiente de Ca2+ con un peso molecular de 35-36 KD, que puede unirse a la PS con alta afinidad. Utilizando la anexina-V marcada con fluoresceína (FITC, Alexa fluor488, etc.) como sonda, se pueden identificar células apoptóticas y células vivas mediante citometría de flujo o microscopio de fluorescencia.

El PS de las células necróticas también se volcará desde la superficie interna de la membrana celular a la superficie externa de la membrana celular. La anexina-V también puede reconocer el PS en la superficie de las células necróticas, por lo que la anexina V no puede distinguir las células necróticas de las células apoptóticas. Además, el yoduro de propidina (PI) es un colorante de ácido nucleico, que puede unirse al ADN en las células, y no puede penetrar la membrana celular completa. La membrana celular de las células apoptóticas tempranas y las células vivas todavía está intacta, y el colorante PI no puede entrar en la célula libremente a través de la membrana celular para unirse con el ADN, por lo que el colorante PI no puede marcar las células apoptóticas y las células vivas, pero el colorante PI puede unirse con el ADN en la célula a través de la membrana celular de las células necróticas. El colorante PI en las células muertas emitirá fluorescencia roja después de ser excitado por un láser de 488 nm, y será recibido por el canal correspondiente. Por lo tanto, la anexina V y el PI se pueden usar juntos para distinguir las células vivas, las células apoptóticas tempranas y las células necróticas.

Figura 2: Análisis de los resultados de la citometría de flujo después de la doble tinción con anexina-v/pi

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2. Apoptosis temprana: tinción de JC-1 (detección de cambios en el potencial de membrana mitocondrial)

El proceso de apoptosis suele ir acompañado de la destrucción del potencial transmembrana mitocondrial, que se considera uno de los primeros acontecimientos del proceso de la cascada de apoptosis. Se produce antes de que aparezcan las características de la apoptosis nuclear (concentración de cromatina, rotura del ADN). Una vez que el potencial transmembrana mitocondrial se colapsa, la apoptosis celular es irreversible. La existencia del potencial transmembrana mitocondrial permite que algunos colorantes fluorescentes catiónicos lipófilos, como la rodamina 123, JC-1, JC-10, se unan a la matriz mitocondrial. El aumento o la disminución de su fluorescencia indica el aumento o la disminución de la electronegatividad de la membrana interna mitocondrial.

JC-1 se utiliza ampliamente para detectar el potencial de membrana mitocondrial △ΨM, mostrando una acumulación dependiente del potencial en las mitocondrias. En las mitocondrias normales, JC-1 se agrega en la matriz mitocondrial para formar un polímero, que emite una fuerte fluorescencia roja (ex=585 nm, em=590 nm); En las células apoptóticas, el potencial transmembrana mitocondrial se despolarizó, JC-1 se liberó de las mitocondrias, la concentración disminuyó y se revirtió a la forma monomérica emitiendo fluorescencia verde. Por lo tanto, el cambio de color refleja directamente el cambio en el potencial de la membrana mitocondrial. El grado de despolarización mitocondrial también se puede medir mediante la relación entre la intensidad de la fluorescencia roja y verde. La detección de JC-1 es un método común.

3. Apoptosis tardía: método TUNEL (método de marcaje in situ de fragmentos de ADN)

En la última etapa de la apoptosis, se produce una gran cantidad de terminales 3-OH pegajosas debido a roturas de doble cadena o roturas de cadena simple del ADN cromosómico. Bajo la acción de la transferasa terminal de desoxirribonucleótido (TdT), el dUTP marcado con luciferasa se puede unir al extremo 3-terminal del ADN, de modo que se pueden detectar células apoptóticas; estos métodos se denominan etiquetado de extremos de mella de dUTP mediado por la desoxirribonucleótido transferasa terminal (TUNEL). Debido a que las células normales o proliferantes casi no tienen roturas de ADN, no hay formación de 3-OH y pocas se pueden teñir. TUNEL es en realidad un método de investigación que combina la biología molecular y la morfología. La tinción in situ de un solo núcleo apoptótico completo o cuerpo apoptótico puede reflejar con precisión las características bioquímicas y morfológicas típicas de la apoptosis. Se puede utilizar para determinar la morfología celular de secciones de tejido embebidas en parafina, secciones de tejido congelado, células cultivadas y células aisladas de tejidos, y puede detectar una cantidad muy pequeña de células apoptóticas, por lo tanto, se utiliza ampliamente en el estudio de la apoptosis.

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