Puromicina es un antibiótico aminoglucósido producido por Streptomyces alboniger. Es un análogo del extremo 3' de la molécula de aminoacil-ARNt y puede unirse al sitio A del ribosoma, incorporándose a la cadena peptídica en extensión, interrumpiendo la translocación del péptido en el ribosoma, causando la terminación prematura de la cadena durante la traducción y, por lo tanto, inhibiendo la síntesis de proteínas.

Figura 1 Fórmula estructural de la puromicina (CAS NO. 53-79-2)

El gen pac, que codifica la N-acetiltransferasa de puromicina (pac), se encontró en la bacteria productora de puromicina Streptomyces alboniger, lo que confiere resistencia a la puromicina. Esta característica se utiliza ahora ampliamente para examinar líneas celulares transfectadas estables de mamíferos que portan plásmidos con el gen pac. El uso generalizado de puromicina en la detección de líneas celulares estables está relacionado con las características de los vectores lentivirales, la mayoría de los cuales portan el gen pac en vectores lentivirales comerciales. En ciertos casos específicos, la puromicina también se puede utilizar para examinar cepas de E. coli transformadas con plásmidos que portan el gen pac. La puromicina actúa rápidamente y puede causar rápidamente la muerte celular a bajas concentraciones. Las células de mamíferos adherentes son sensibles a concentraciones de 2-5 µg/mL de puromicina, mientras que las células en suspensión ya son sensibles a concentraciones tan bajas como 0,5-2 µg/ml de puromicina. Se pueden generar células de mamíferos con resistencia estable a la puromicina en una semana.

Detección de líneas celulares estables

Principio experimental

Al clonar ADN/shRNA exógeno en un vector que lleva el gen pac, el vector recombinante se transfecta en células huésped y se integra en sus cromosomas, se transmite de manera estable con la división celular y, finalmente, se analiza con puromicina.

Preparación y pre-experimento

1 Concentraciones de uso recomendadas

Células de mamíferos: 1-10 μg/mL, la concentración óptima debe determinarse mediante un experimento previo.

E. coli: para la detección de E. coli transformadas estables que portan el gen pac en medio de agar LB, utilice una concentración de 125 μg/mL. Se requiere un ajuste preciso del pH para la detección de E. coli transformantes estables con puromicina.

2 Método de disolución

Disuelva la puromicina en agua destilada para preparar una solución madre de 50 mg/mL, esterilice por filtración con un filtro de 0,22 μm, divida en alícuotas y almacene a -20 °C.

3 Determinación de la curva de eliminación de puromicina (utilizando la transfección de shRNA o la transducción lentiviral como ejemplo)

La concentración de puromicina efectiva para la detección está relacionada con el tipo de célula, el estado de crecimiento, la densidad celular, el metabolismo celular y la posición del ciclo celular. Es fundamental determinar la concentración mínima de puromicina que mata las células no transfectadas. Es esencial realizar un gradiente de detección de puromicina antes del experimento inicial para establecer una curva de muerte.

• Células de placa a una densidad de 5~8×10⁴células/pocillo en una placa de 24 pocillos y cultivar durante la noche.
• Preparar medio de detección: medio fresco que contenga diferentes concentraciones de puromicina (por ejemplo, 0-15 μg/mL, al menos 5 gradientes).
• Reemplace con medio de detección recién preparado, continúe cultivando y observe el crecimiento celular, cambiando el medio de detección nuevo cada 2-3 días.
• Observe diariamente la supervivencia celular; la concentración del fármaco que mata eficazmente todas las células no transfectadas en un plazo de 4 a 6 días es la concentración mínima.

Detección de transfectantes estables

• Después de una infección lentiviral durante 48-72 h (confluencia del 70-80 %), las células se cultivan en un medio que contiene una concentración adecuada de puromicina durante al menos 48 h. Cuando todas las células del grupo de control no transfectado con puromicina mueren, las células restantes del grupo infectado con el virus son todas células positivas.

【Nota】: ① El efecto de los antibióticos es más pronunciado cuando las células están en una fase de división activa. La eficacia de los antibióticos se reducirá significativamente si las células son demasiado densas. La densidad celular no debe superar el 25%. ② Observe el estado de crecimiento celular diariamente; el cribado de puromicina requiere al menos 48 h, y la concentración efectiva del cribado de puromicina suele durar de 3 a 10 días. Cuanto mayor sea el MOI del virus, más copias de shRNA y gen de resistencia a la puromicina contiene cada célula. Al realizar el cribado de puromicina, cuanto mayor sea el MOI, más copias de pac contienen las células y mayor es la concentración de puromicina que pueden tolerar. Ajuste la concentración de puromicina para cribar las células transfectadas, pero la concentración de puromicina no debe ser inferior a la concentración mínima efectiva de la curva de muerte;

• Agregue medio de cultivo que contenga la concentración mínima de Puromicina para expandir las células y, una vez calificados los resultados de la prueba qPCR, proceda con la criopreservación.

Productos nombre	Gato#	Especificación	Apariencia
Puromicina Dihidrocloruro Número de serie: 58-58-2	60210ES25	25 mg	De color blanco a un polvo blanquecino
	60210ES60	100 mg
	60210ES72	250 mg
	60210ES76	500 mg
	60210ES80	1 gramo
Puromicina (Solución 10 mg/mL) Número de serie: 58-58-2	60209ES10	1 x 1 ml	Solución (10 mg/ml en H2O）
	60209ES50	5 x 1 ml
	60209ES60	10x1 ml
	60209ES76	50 x 1 ml

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