Acerca de la ligasa de ADN T4
Fig. 1 Diagrama esquemático del principio de reacción de la ADN ligasa T4[1]
Cribado experimental iterativo en seco y húmedo para obtener la ligasa de ADN T4 de alto rendimiento
La ligasa de ADN T4, una enzima ligasa dependiente de ATP, comprende un dominio de unión al ADN de hélice compacta (DBD), un dominio de nucleotidil-transferasa (NTasa) y un dominio de pliegue OB. Basándose en la estructura de la proteína, la equipo Analizaron los residuos que abarcaban distancias de 5 a 20 Å alrededor del sustrato de ADN, seguido de un análisis in silico y de estructura-función utilizando herramientas computacionales avanzadas. Durante este proceso, el equipo observó un bucle flexible situado lejos del bolsillo activo. Guiado por cálculos de energía, el equipo Diseñaron truncamientos en esta región de bucle, con la hipótesis de que esto podría no afectar significativamente la función de ligadura, pero podría afectar la estabilidad estructural general. Además, el equipo Se alinearon secuencias de consenso para diseñar mutantes, acoplando este análisis con consideraciones estructurales y funcionales, como se ilustra en la siguiente figura.
Además del diseño racional, se llevó a cabo la evolución dirigida de la ADN ligasa T4 con el método MTPS mediante el análisis de la estabilidad, la actividad y la actividad residual. Y se obtuvo una biblioteca de más de 104 Se examinaron los mutantes G1. Tras un análisis exhaustivo de los datos de mutación, se seleccionaron candidatos prometedores para su purificación y pruebas rigurosas. A continuación, todos los ganadores obtenidos mediante diseño racional y evolución dirigida se sometieron a una caracterización detallada después de una purificación refinada, que abarcó evaluaciones de actividad, estabilidad, autoligación de adaptadores, autoligación de fragmentos de ADN y rendimiento de ADN. Basándose en los mutantes G1, el equipo Se realizó una mezcla de ADN y un diseño combinado de mutaciones dirigidas para obtener mutantes excepcionales que satisfagan diversos requisitos de aplicación.
De mutante a producto comercializable con múltiples rondas de validación de secuenciación
El Editor de zymeMT. La plataforma de evolución de enzimas ha desarrollado con éxito un mutante de ligasa de ADN T4 con alta estabilidad térmica, alto rendimiento de biblioteca y baja autoligación de adaptadores a través de la tecnología de evolución de enzimas. Se ha lanzado con éxito la actualmente mejorada T4 DNA Ligase: Hieff® Versatile T4 DNA Ligase (600 U/μL) (Cat#12996ES). Este producto supera a la ligasa de ADN T4 de tipo salvaje tradicional en términos de eficiencia de ligadura y estabilidad térmica, y ha sido verificado mediante secuenciación de alto rendimiento, lo que garantiza una calidad excelente.
Presentación de datos
1. Mayor estabilidad térmica
Los mutantes de la ADN ligasa T4 de Yeasen se sometieron a un tratamiento térmico a 42 ℃ durante 0, 2 y 4 horas, y se compararon con las ligasas de ADN T4 de los proveedores Q, N, A y T.Posteriormente, se construyó una biblioteca de ADN de genoma completo utilizando 1 µg de ADNg bovino fragmentado con el kit de construcción de biblioteca de ADN de Yeasen (Cat#12927ES) para comparar la estabilidad térmica de la ADN ligasa T4.
Figura 3 Prueba de estabilidad térmica a 42 ℃
Resultados:
Estabilidad térmica: Yeasen ≈ Proveedor N ≈ Proveedor A > Proveedor T > Proveedor Q.
2. Mayor rendimiento de la biblioteca
Se probó el mutante T4 ADN Ligasa de Yeasen para el rendimiento de la biblioteca en niveles de entrada de ADN altos y bajos, en comparación con las T4 ADN Ligasas de los proveedores Q, N, A y T. Se utilizó el kit de construcción de biblioteca de ADN de Yeasen (Cat#12927ES), con 1 µg y 0,5 ng de ADNg bovino fragmentado como entrada para construir bibliotecas de ADN.
3.Autoligadura del adaptador inferior
Se comparó el mutante de la ligasa de ADN T4 de Yeasen con las ligasas de ADN T4 de los proveedores Q, N, A y T para la autoligación del adaptador. Se utilizó el kit de construcción de bibliotecas de ADN de Yeasen (n.° de cat. 12927ES), con 0 ng y 0,5 ng de ADN genómico bovino fragmentado como entrada para construir bibliotecas de ADN de todo el genoma.
Contáctenos
Yeasen ha superado con éxito las limitaciones de las ligasas de ADN T4 tradicionales, ofreciendo un producto de ligasa de ADN T4 que se destaca en estabilidad térmica, rendimiento de la biblioteca y autoligación del adaptador. En este proceso, la empresa ha acumulado una rica biblioteca de mutantes, brindando a los investigadores una variedad de opciones para satisfacer diferentes necesidades experimentales. Si está interesado en nuestros productos o mutantes de ligasa de ADN T4, no dude en contactarnos a través de los siguientes métodos.Serie de productos de ligasa de ADN T4 de Yeasen
| posicionamiento del producto | Nombre del producto | N.º de cat. |
| Alta estabilidad térmica y baja tasa de autoligación. | Hieff® Ligasa de ADN T4 versátil (600 U/μL) | 12996ES |
| Ligadura rápida y eficiente, bajos residuos, perfectamente adecuada para las necesidades de detección de patógenos. | Ligasa de ADN T4 rápida (400 U/µL) | 10299ES |
| modelo universal | Ligasa de ADN T4 rápida (400 U/µL) | 10301ES |
Referencias
[1] Ligasas de ADN Shuman S: avances y perspectivas[Yo]Revista de Química Biológica, 2009, 284(26):17365-17369.