La ARNasa HII, también conocida como ARNasa H2, es una endorribonucleasa que ataca específicamente y corta el enlace fosfodiéster en el extremo 5' de un ribonucleótido solitario ubicado dentro de una hélice de ADN bicatenario, lo que produce un grupo fosfato 5' y un grupo hidroxilo 3' (Fig. 1). Esta enzima exhibe una actividad de escisión mínima hacia el ARN monocatenario y es inactiva tanto contra el ADN bicatenario (dsADN) como contra el ADN monocatenario (ssADN). Funcionalmente activa dentro del rango de temperatura de 50 °C a 75 °C, la ARNasa HII alcanza un rendimiento máximo a temperaturas entre 70 °C y 75 °C. Aprovechando su capacidad única para realizar una escisión dirigida en un solo sitio en los sitios de ADN donde se integra un ribonucleótido, sin afectar al dsADN o ssADN, la ARNasa HII sirve como un "disparador" de precisión para el inicio de la reacción, incluida la activación y extensión del cebador, para lograr una amplificación específica. Esta enzima desempeña un papel fundamental en la PCR dependiente de ARNasa H (rhPCR), la tecnología de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) y la degradación de componentes de ARN en fragmentos de Okazaki.
Fig. 1. Diagrama esquemático del principio de reacción de la ARNasa HII
Las aplicaciones funcionales de la ARNasa HII
PCR dependiente de ARNasa H(PCR humana recombinante)
La rhPCR incorpora la ARNasa HII y cebadores de rhPCR especialmente diseñados y escindibles en el proceso de PCR. Este enfoque aprovecha la propiedad única de la ARNasa HII de hidrolizar selectivamente el ARN dentro de los híbridos ADN-ARN, mientras que deja intactos los enlaces fosfodiéster en el ADN y ARN monocatenarios o bicatenarios. Como resultado, la ARNasa HII solo digiere el híbrido ADN-ARN y permite la extensión del cebador cuando el cebador es perfectamente complementario a la secuencia de ADN objetivo. Esta acción dirigida mejora significativamente la precisión de la reacción. La ARNasa HII es la única enzima capaz de iniciar la eliminación precisa de ribonucleótidos sin inducir mutaciones al escindir el extremo 5' del ácido ribonucleico. Debido a su alta especificidad, sensibilidad y reproducibilidad, la rhPCR ofrece ventajas distintivas en aplicaciones como la detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), la tipificación genética, la detección simultánea de múltiples objetivos y el análisis de ácidos nucleicos ambientales.
Ruta técnica
1. Diseño de la cartilla
El diseño del cebador debe garantizar que la temperatura de fusión después del corte sea mayor que la temperatura de hibridación para garantizar que el cebador se una de manera estable a la plantilla durante los ciclos de PCR. El cebador de PCR humana recombinante consta de tres partes:
1) Segmento de ADN 5': comparable en longitud y requisitos de temperatura de fusión (Tm) a los cebadores de PCR estándar, puede emparejarse eficazmente con el ADN plantilla y extenderse desde él después de ser cortado por la enzima ARNasa HII.
2) Una sola base de ARN: proporciona un sitio de corte para la ARNasa HII.
3) Segmento de ADN 3': una longitud de cuatro o cinco bases con un bloqueador, normalmente una molécula corta y no extensible como el propilenglicol, que impide la extensión de la ADN polimerasa hasta que se elimine el bloqueador.
2.Corte y extensión
Al comienzo de la reacción de PCR humana recombinante, el cebador y el ADN molde están libres. Cuando el cebador se une al molde del heterodúplex ARN:ADN específico, la enzima ARNasa HII reconoce y corta el lado 5' de la base de ARN del cebador bloqueado, dejando un oligonucleótido de ADN con un grupo hidroxilo 3', que proporciona un punto de partida para que la ADN polimerasa se extienda. A continuación, se lleva a cabo el proceso de amplificación por PCR convencional.
Fig. 2. Diagrama del principio de la rhPCR [1]
Sí.Amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP)
La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es un método simple y rápido para la amplificación de genes que puede amplificar ácidos nucleicos en condiciones isotérmicas en un corto período de tiempo. Sin embargo, debido a la iniciación de la actividad de la ADN polimerasa durante la preparación a temperatura ambiente, se forman desajustes no específicos, lo que puede dar lugar a una pequeña cantidad de desajustes y dímeros de cebadores, lo que causa contaminaciones menores que pueden dar lugar a falsos positivos.
La aplicación de la ARNasa HII al sistema de amplificación LAMP puede abordar de manera eficaz el problema de los falsos positivos en la tecnología LAMP, ampliando su aplicación en el diagnóstico clínico. Como se muestra en la Figura 3, el método LAMP activado por cebador (PA-LAMP) que utiliza la ARNasa HII, cuando el cebador se empareja con el ssDNA objetivo, la enzima ARNasa HII escinde específicamente el ARN en el cebador, lo activa y permite la extensión del cebador, logrando una amplificación específica y reduciendo de manera eficaz los falsos positivos en el sistema.
Fig. 3. Diagrama esquemático del principio PA-LAMP [2]
ARNasa HII de YEASEN
ARNasa HII de YEASEN (Cat. n.° 14539) se deriva de Pyrococcus abyssi, PaAdemás, está libre de nucleasas contaminantes, enzimas de corte y residuos de ARNasa, con una baja contaminación del ADN del huésped, lo que reduce eficazmente los falsos positivos en el sistema. La ARNasa HII de YEASEN es extremadamente resistente al calor y mantiene su actividad incluso después de 30 minutos a 95 °C, lo que la hace compatible con varios sistemas de reacción de PCR humana recombinante y también adecuada para LAMP y otras aplicaciones.
1. E. coli residuo de ADN genómico < 0,5 copias/100 U
Detección de E. coli Los residuos de ADN genómico en diferentes lotes de ARNasa HII mostraron que el residuo de ADN genómico del huésped de la ARNasa HII de YEASEN está muy por debajo de 0,5 copias/100 U.
Fig 4. Detección de E. coli residuo de ADN genómico
2. Prueba de resistencia al calor a 95 °C
Después de calentar la ARNasa HII a 95 °C durante 0 a 45 minutos, se analizó la actividad enzimática de la ARNasa HII. Los resultados indicaron que casi no hubo pérdida de actividad enzimática en la ARNasa HII de YEASEN incluso después de 45 minutos de calentamiento.
Fig. 5. Prueba de resistencia al calor a 95 °C
3. Sin exonucleasa, enzima de corte ni residuo de ARNasa (dosis de 1 U)
Al incubar 1 U de diferentes lotes de ARNasa HII con sus respectivos sustratos ADN/ARN a 37 °C durante 4 horas, los resultados de la electroforesis en gel de agarosa indicaron que no había exonucleasa, enzima de mellado ni residuo de ARNasa en la ARNasa HII.
Figura 6.Resultados de detección de exonucleasa, enzima de corte y residuo de ARNasa
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Referencias
[1] Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Rupp SM, Powers KM, Behlke MA, Walder JA. PCR dependiente de ARNasa H (rhPCR): especificidad mejorada y detección de polimorfismos de un solo nucleótido utilizando cebadores escindibles bloqueados. BMC Biotechnol. 10 de agosto de 2011;11:80. doi: 10.1186/1472-6750-11-80.
[2] Du WF, Ge JH, Li JJ, et al. Detección de alta especificidad en un solo paso de una mutación de un solo nucleótido mediante amplificación isotérmica mediada por bucle activable por cebador (PA-LAMP)[J]. Analytica chimica acta, 2019(1050-):1050.DOI:10.1016/j.aca.2018.10.068.