Figura 1. Diagrama esquemático de la DNasa I que corta el dsADN en presencia de Mg²⁺ y Mn²⁺

La DNasa I común se purifica principalmente a partir del páncreas bovino o es una enzima recombinante. En comparación con la DNasa I purificada a partir del páncreas bovino, la DNasa I recombinante tiene niveles de ARNasa endógena relativamente más bajos o se puede formular como productos sin ARNasa, lo que la hace más adecuada para aplicaciones sensibles a la ARNasa, como la eliminación de ADN de muestras de ARN.

Aplicaciones

En cuanto a las aplicaciones, la DNasa I es bien conocida por su uso en experimentos relacionados con el mantenimiento de la integridad del ARN, como la extracción de ARN libre de ADN, la preparación de plantillas de ARN sin ADN genómico antes de la transcripción inversa y la degradación de plantillas de ADN después de la transcripción in vitro. Además, se puede utilizar para digerir sondas de ADN en la eliminación de ARNr, para el etiquetado de ADN a través de la traducción de mellas, el análisis de interacciones ADN-proteína mediante el método de huella de ADN, la generación de bibliotecas de ADN aleatorias, la reducción de la viscosidad de lisados ​​celulares o extractos de proteínas, la digestión de adherencias celulares como aditivo en cultivos celulares y la escisión parcial de ADN genómico como control positivo en ensayos TUNEL para la detección de apoptosis. En resumen, la DNasa I se puede utilizar en casi cualquier aplicación que requiera la digestión enzimática del ADN. A continuación, se proporcionará una breve introducción a varias aplicaciones comunes.

• Eliminación de ADN genómico antes de la extracción de ARN o transcripción inversa

El ARN, como muestra que se estudia habitualmente en los laboratorios, influye en gran medida en la calidad de los datos experimentales debido a su propia calidad. Por lo general, es imposible evitar por completo los residuos de ADN genómico durante el proceso de extracción de ARN. Por lo tanto, antes de realizar aplicaciones posteriores complejas (como el análisis de la expresión de ARNm, el análisis del transcriptoma, etc.), generalmente se recomienda tratar las muestras de ARN con DNasa I para digerir el ADN genómico residual. La digestión del ADN genómico se puede llevar a cabo durante la extracción de ARN, después de la extracción de ARN o antes de la transcripción inversa del ARN.

Figura 2. Proceso de eliminación de ADN genómico basado en DNasa I

• Eliminación de ADN molde en la transcripción in vitro

La transcripción in vitro (IVT) utiliza principalmente ADN como plantilla para producir ARN bajo la influencia de sustratos y soluciones tampón adecuadas. Las ARN polimerasas que se utilizan habitualmente en este proceso son T7, T3 y SP6, que son responsables de catalizar la síntesis de ARN. Sin embargo, el producto de ARN sintetizado puede contener residuos de ADN, y la eliminación de estos residuos es beneficiosa para los experimentos posteriores.

Especialmente en el proceso de desarrollo de vacunas de ARNm, la eliminación de estos residuos de ADN es un paso crítico que afecta directamente la dificultad de los procesos de purificación posteriores y la pureza del producto final.Para eliminar eficazmente el ADN molde, normalmente se utiliza DNasa I como tratamiento para garantizar que la muestra de ARN esté libre de residuos de ADN, un paso que ayuda a mejorar la precisión y la eficiencia generales del experimento.

Figura 3: Proceso de transcripción in vitro utilizando plásmido linealizado como plantilla^[4]

• Eliminación de ARNr en la construcción y secuenciación de bibliotecas de ARN

En los organismos, el ARNr es muy abundante y está muy conservado, lo que tiene poca importancia para la obtención de información biológica en la investigación. Sin embargo, el 95% del ARN total extraído durante los experimentos es ARNr humano, y la presencia de estos ARNr puede interferir con la detección de los ARN diana. Por lo tanto, en la preparación y secuenciación de bibliotecas de ARN, el ARNr generalmente se elimina primero. Actualmente, el método principal para la eliminación de ARNr es la digestión con ARNasa, y su principal Los pasos y principios son los siguientes:

1. Extraer ARN total;
2. Hibridar sondas de ADN monocatenario con moléculas de ARNr (Nota: Diseñar y sintetizar sondas de ADN monocatenario específicas de ARNr);
3. La ARNasa H degrada el ARNr hibridado;
4. La ADNasa I degrada las sondas de ADN;
5. El ARNr se elimina con éxito, dejando plantillas de ARN que no son ARNr.

Figura 4: Diagrama esquemático del principio de eliminación de ARNr basado en el método enzimático^[5]

• Traducción de apodos para etiquetado de ADN

La traducción de muescas es el método más utilizado para etiquetar sondas de ácido desoxirribonucleico en el laboratorio. Este método se logra mediante la acción combinada de la DNasa I y E. coli ADN polimerasa I.

El principio fundamental es el siguiente:

1. En primer lugar, utilice una concentración adecuada de ADNasa I para crear varias mellas de cadena sencilla en cada cadena del ADN de doble cadena que se va a etiquetar, formando extremos hidroxilo 3' en los sitios de las mellas.
2. Luego, utilice la actividad exonucleasa 5'→3' de coliLa ADN polimerasa I elimina un nucleótido del extremo 5' de la mella, mientras que la actividad de la polimerasa 5'→3' de MI. coli La ADN polimerasa I introduce un nucleótido marcado en el extremo 3' de la muesca para repararla. A medida que la muesca se desplaza a lo largo de la cadena de ADN, los nucleótidos marcados se incorporan a la cadena de ADN recién sintetizada.

Figura 5: Diagrama esquemático del principio del etiquetado de ADN por traducción de mellas^[6]

• Experimento de ensayo de huellas de ADNasa I

El ensayo de huella de ADN de la DNasa I es un método preciso para identificar los sitios de unión de las proteínas que se unen al ADN en las moléculas de ADN. El principio es que las proteínas unidas a un fragmento de ADN protegen la región unida de la degradación por la DNasa I. Después de la digestión enzimática, el fragmento restante (la "huella") se puede utilizar para determinar su secuencia. En la imagen del gel, no hay bandas correspondientes a las regiones donde se une la proteína.

El principio fundamental es el siguiente:

1. Etiquete los extremos monocatenarios de la molécula de ADN bicatenario que se va a analizar.
2. Mezclar la proteína con ADN y añadir una cantidad adecuada de DNasa I para la digestión enzimática, formando fragmentos de ADN de longitudes variables.Se debe controlar la cantidad de enzima para garantizar que los fragmentos de ADN adyacentes difieran solo en un nucleótido y se debe incluir en paralelo un control sin proteína añadida.
3. Retirar la proteína del ADN, separar el ADN desnaturalizado mediante electroforesis PAGE y autorradiografía para interpretar la secuencia de nucleótidos de la región de la huella en comparación con el grupo de control.

Figura 6: Diagrama esquemático del principio del ensayo de huella de DNasa I^[7]

El DNasa I Guía de selección de Yeasen

Para satisfacer diversas necesidades de aplicación, Yeasen ofrece recombinant DNasa I en E. coliy puede proporcionar DNasa I de grado GMP para satisfacer los requisitos de transcripción in vitro de ARNm y otras aplicaciones.

Posicionamiento del producto	Solicitud	Nombre del producto	Número de catálogo
Libre de ARNasa	eliminación de ADN de preparaciones de ARN y proteínas	DNasa I recombinante (libre de ARNasa)	10325ES
Grado GMP, Libre de ARNasa	Transcripción in vitro de ARNm	Desoxirribonucleasa I (DNasa I) UCF.ME® de grado GMP	10611ES

Referencias

[1] Ndiaye C, Mena M, Alemany L, et al. Detección de ADN del VPH, ARNm de E6/E7 y p16INK4a en cánceres de cabeza y cuello: una revisión sistemática y metanálisis[J]. The Lancet Oncology, 2014, 15(12): 1319-1331.

[2] Broccolo F, Fusetti L, Rosini S, et al. Comparación de la carga de ADN viral oncogénico específico del tipo de VPH y la detección de ARNm E6/E7 en muestras cervicales: resultados de un estudio multicéntrico[J]. Journal of medical virology, 2013, 85(3): 472-482.

[3] Huang Z, Fasco MJ, Kaminsky L S. Optimización de la eliminación de ADN contaminante del ARN mediante la ADNasa I para su uso en PCR cuantitativa de ARN[J]. Biotechniques, 1996, 20(6): 1012-1020.

[4] Kang DD, Li H, Dong Y. Avances del ARNm transcrito in vitro (ARNm IVT) para permitir la traducción en la práctica clínica[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2023, 199: 114961.

[5] Wiame I, Remy S, Swennen R, et al. Inactivación térmica irreversible de la DNasa I sin degradación del ARN[J]. Biotechniques, 2000, 29(2): 252-256.

[6] Adolph S, Hameister H. Traducción in situ de cromosomas en metafase con d-UTP marcado con biotina[J]. Genética humana, 1985, 69: 117-121.

[7] Song C, Zhang S, Huang H. Elección de un método adecuado para la identificación de orígenes de replicación en genomas microbianos. Frontal Microbiol, 2015, 6: 1049.