Con el rápido desarrollo de pagproteína sLa tecnología de purificación de proteínas desempeña un papel cada vez más importante en el campo de la investigación biológica y la industria biotecnológica. Como técnica principal, implica la integración de la información de codificación de la proteína objetivo en las células huésped a través de métodos de ingeniería genética, de modo que se las pueda inducir a producir de manera eficiente las proteínas requeridas. Posteriormente, se llevan a cabo una serie de sofisticados pasos de operación in vitro para lograr la extracción de proteínas de alta pureza. La purificación de proteínas permite a los científicos aislar tipos individuales de proteínas, lo que es crucial para estudios en profundidad sobre la estructura y función de las proteínas, el desarrollo de nuevos medicamentos, el diagnóstico de enfermedades y la promoción de la aplicación de la biotecnología. Esta tecnología no solo garantiza la precisión de los experimentos científicos, sino que también impulsa continuamente el desarrollo de las ciencias de la vida.
Figura 1. Diagrama esquemático de la cromatografía de afinidad.[1]
En el campo de la ingeniería de proteínas, las etiquetas de fusión son una herramienta poderosa que puede facilitar diversos propósitos experimentales al unirse a las proteínas objetivo. Las funciones de las etiquetas de fusión más comunes se enumeran en la siguiente tabla como referencia. Sin embargo, una vez que estas etiquetas permanecen en las proteínas de fusión después de cumplir con sus funciones auxiliares iniciales, pueden tener efectos adversos en experimentos posteriores, como interferir con experimentos inmunológicos animales o afectar la actividad biológica de las proteínas. Por lo tanto, es crucial eliminar estas etiquetas de fusión innecesarias para garantizar el funcionamiento normal de las proteínas y la precisión de los experimentos.
Tabla 1. Introducción a las funciones de las etiquetas de fusión comunes y los métodos de escisión enzimática
| Etiqueta de fusión | Tamaño (KDa) | Función | Métodos comunes de escisión enzimática |
| Su | 0,84 | Beneficioso para la purificación, capaz de purificar proteínas de cuerpos de inclusión/solubles. | Proteasa TEV |
| Bandera | 1.01 | La proteína de propósito fusionada con Fretraso La etiqueta puede ser reconocida por el anticuerpo contra Fretraso, de modo que la proteína de fusión que contiene Fretraso La etiqueta se puede detectar e identificar mediante Western Blot, ELISA y otros métodos. | Enteroquinasa |
| Impuesto sobre bienes y servicios | 26 | Mejora la solubilidad de las proteínas, solo capaz de purificar proteínas solubles y proteger las proteínas tóxicas. | Trombina |
| MBP | 44.4 | Mejorar la solubilidad de las proteínas y proteger las proteínas tóxicas. | Proteasa TEV |
| NusA | 55 | Mejorar la solubilidad de las proteínas y proteger las proteínas tóxicas. | Trombina |
| SUMO | 11.2 | Mejora la solubilidad de las proteínas, promueve la proteína de la proteolítica. hidrólisis y mejorar la estabilidad de las proteínas. | Proteasa SUMO |
Hoy, estamos encantados de presentarles un producto de vanguardia para la eliminación eficiente y precisa de etiquetas de fusión: UCF.MEMT. Proteasa rTEV. Con un procedimiento experimental sencillo y de fácil manejo, esta enzima puede separar fácilmente las etiquetas innecesarias de las proteínas de fusión, obteniendo así proteínas objetivo de alta pureza.
UCF.MEMT. Proteasa rTEV
La proteasa TEV es una proteasa ampliamente utilizada para la escisión de etiquetas de fusión de proteínas recombinantes, conocida por su alta especificidad de sitio. Reconoce estrictamente la secuencia de siete aminoácidos EXXYXQ↓(G/S) y realiza una escisión precisa entre glutamina y glicina o serina. La secuencia de siete aminoácidos más común es Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓-Gly. Esta especificidad garantiza la precisión y eficiencia en el procedimiento de procesamiento de proteínas.
Figura 2. Diagrama esquemático del mecanismo de acción de la proteasa TEV[2]
UCF.MEMT. La proteasa rTEV es una proteasa recombinante que ha sido modificada genéticamente y purificada con precisión. No solo conserva la actividad funcional completa de la enzima TEV natural, sino que también muestra una excelente estabilidad y especificidad en un rango de temperaturas más amplio. El residuo de ADNg del huésped de tSu producto es muy bajo, lo que garantiza una mayor eficiencia de corte de las etiquetas de fusión de proteínas en aplicaciones prácticas y reduce eficazmente el riesgo de introducir residuos de sustancias exógenas. UCF.MEMT. La proteasa rTEV exhibe una actividad óptima en condiciones de pH 7,0 y 30 °C. Sin embargo, mantiene la actividad incluso en un amplio rango de condiciones con pH 6,0-8,5 y temperatura 4-30 °C, para cumplir con los diferentes requisitos de procesamiento de proteínas. Vale la pena mencionar que UCF.MEMT. La proteasa rTEV tiene una etiqueta 6×His en su extremo N, que puede eliminarse eficientemente con resina Ni-NTA, logrando así una purificación precisa de la proteína objetivo.
Visualización del rendimiento
1. Alta eficiencia de escisión: la etiqueta de proteína se escinde más completamente
Utilizando la proteína de fusión (3 μg) que contiene el UCF.MEMT. Sitio de escisión de la proteasa rTEV como sustrato, UCF.MEMT. Se añadió la proteasa rTEV a 10, 5 y 3 U respectivamente y la reacción se llevó a cabo a 30 °C durante 1 h. El efecto de escisión se detectó mediante electroforesis en gel de agarosa. Los resultados mostraron que Yaliviarde UCF.MEMT. La proteasa rTEV pudo escindir el sustrato de manera eficiente cuando la cantidad de entrada fue superior a 3 U, con una eficiencia de escisión de >90%.
Figura 3. Verificación de la actividad de escisión de UCF.MEMT. Proteasa rTEV
2. Residuos bajos de ADN genómico del huésped: reduce eficazmente el riesgo de introducir residuos de sustancias exógenas
Al probar el host (E. coli) Residuos de ADN genómico en diferentes lotes de UCF.MEMT. Proteasa rTEV, los resultados mostraron que el residuo de ADNg del huésped de UCF.MEMT. La proteasa rTEV estaba muy por debajo de <1 copia/U.
Figura 4. Resultados del residuo de ADNg del huésped en UCF.MEMT. Proteasa rTEV
3. Amplias condiciones de aplicación: capaz de satisfacer diferentes requisitos de procesamiento de proteínas.
Al verificar la actividad de escisión de UCF.MEMT. Proteasa rTEV en diferentes condiciones, los resultados mostraron que UCF.MEMT. La proteasa rTEV tuvo una fuerte actividad en condiciones de 4 a 30 °C, lo que podría satisfacer los diferentes requisitos de aplicación de los clientes.
| Tiempo de reacción (yo) | Actividad de escisión a diferentes temperaturas. (%) | |||
| 4℃ | 16℃ | 21℃ | 30℃ | |
| 1 | 34 | 58 | 56 | 85 |
| 2 | 58 | 80 | 78 | 90 |
| 3 | 71 | 99 | 99 | 99 |
| 3.5 | 84 | 99 | 99 | 99 |
YaliviarProductos de proteína de corte de etiqueta de fusión recomendados por
| Producto Nombre | Producto norteocre oscuro | |
| TEV Proteasa | UCF.MEMT. Proteasa rTEV | 20427ES |
| Enteroquinasa | Enteroquinasa recombinante | 20395ES |
| Proteasa SUMO | Proteasa SUMO | 20410ES |
| Proteasa 3C | Proteasa 3C | 20409ES |
Referencias:
[1] Parikh I, Cuatrecasas P. Cromatografía de afinidad[J].Vox Sanguinis, 1972, 23(1-2):141-146.DOI:10.1159/000466530.
[2] Paththamperuma C, Page R C. Ensayo de desactivación de fluorescencia para la actividad de la proteasa TEV[J]. Bioquímica analítica, 2022, 659: 114954.