Con el rápido desarrollo de pagproteína sEn la ciencia, la tecnología de purificación de proteínas desempeña un papel cada vez más importante en el campo de la investigación biológica y la industria biotecnológica. Como técnica fundamental, implica la integración de la información codificante de la proteína diana en las células huésped mediante métodos de ingeniería genética, de modo que puedan ser inducidas a producir eficientemente las proteínas requeridas. Posteriormente, se llevan a cabo una serie de sofisticadas operaciones in vitro para lograr la extracción de proteínas de alta pureza. La purificación de proteínas permite a los científicos aislar tipos específicos de proteínas, lo cual es crucial para estudios profundos sobre la estructura y función de las proteínas, el desarrollo de nuevos fármacos, el diagnóstico de enfermedades y la promoción de la aplicación de la biotecnología. Esta tecnología no solo garantiza la precisión de los experimentos científicos, sino que también impulsa continuamente el desarrollo de las ciencias de la vida.
Figura 1. Diagrama esquemático de la cromatografía de afinidad.[1]
En el campo de la ingeniería de proteínas, las etiquetas de fusión constituyen una herramienta poderosa que facilita diversos experimentos al unirse a las proteínas diana. Las funciones de las etiquetas de fusión comunes se enumeran en la tabla a continuación como referencia. Sin embargo, una vez que estas etiquetas permanecen en las proteínas de fusión tras cumplir sus funciones auxiliares iniciales, pueden tener efectos adversos en experimentos posteriores, como interferir con experimentos inmunológicos en animales o afectar la actividad biológica de las proteínas. Por lo tanto, es crucial eliminar estas etiquetas de fusión innecesarias para garantizar el funcionamiento normal de las proteínas y la precisión de los experimentos.
Tabla 1. Introducción a las funciones de las etiquetas de fusión comunes y los métodos de escisión enzimática
| Etiqueta de fusión | Tamaño (KDa) | Función | Métodos comunes de escisión enzimática |
| Su | 0.84 | Beneficioso para la purificación, capaz de purificar proteínas solubles/de cuerpos de inclusión. | Proteasa TEV |
| Bandera | 1.01 | La proteína de propósito fusionada con Fretraso La etiqueta puede ser reconocida por el anticuerpo contra Fretraso, de modo que la proteína de fusión que contiene Fretraso La etiqueta se puede detectar e identificar mediante Western Blot, ELISA y otros métodos. | Enteroquinasa |
| Impuesto sobre bienes y servicios | 26 | Mejora la solubilidad de las proteínas, solo capaz de purificar proteínas solubles y proteger las proteínas tóxicas. | Trombina |
| MBP | 44.4 | Mejorar la solubilidad de las proteínas y proteger las proteínas tóxicas. | Proteasa TEV |
| NusA | 55 | Mejorar la solubilidad de las proteínas y proteger las proteínas tóxicas. | Trombina |
| SUMO | 11.2 | Mejora la solubilidad de las proteínas, promueve la síntesis proteolítica de proteínas. hidrólisis y mejorar la estabilidad de las proteínas. | Proteasa SUMO |
Hoy, estamos encantados de presentarles un producto de vanguardia para la eliminación eficiente y precisa de etiquetas de fusión: UCF.MEMarca registrada Proteasa rTEV. Gracias a su procedimiento experimental simple y fácil de usar, esta enzima puede escindir fácilmente las etiquetas innecesarias de las proteínas de fusión, obteniendo así proteínas diana de alta pureza.
UCF.MEMarca registrada Proteasa rTEV
La proteasa TEV es una proteasa ampliamente utilizada para la escisión de etiquetas de fusión de proteínas recombinantes, conocida por su alta especificidad de sitio. Reconoce estrictamente la secuencia de siete aminoácidos EXXYXQ↓(G/S) y realiza una escisión precisa entre glutamina y glicina o serina. La secuencia de siete aminoácidos más común es Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓-Gly. Esta especificidad garantiza la precisión y eficiencia del procesamiento de proteínas.
Figura 2. Diagrama esquemático del mecanismo de acción de la proteasa TEV[2]
UCF.MEMarca registrada La proteasa rTEV es una proteasa recombinante modificada genéticamente y finamente purificada. No solo conserva la actividad funcional completa de la enzima TEV natural, sino que también presenta una excelente estabilidad y especificidad en un amplio rango de temperaturas. El residuo de ADNg del huésped de tSu producto es muy bajo, lo que garantiza una mayor eficiencia de corte de las etiquetas de fusión de proteínas en aplicaciones prácticas y reduce eficazmente el riesgo de introducir residuos de sustancias exógenas. UCF.MEMarca registrada La proteasa rTEV exhibe una actividad óptima en condiciones de pH 7,0 y 30 °C. Sin embargo, mantiene su actividad incluso en un amplio rango de condiciones, con pH 6,0-8,5 y temperatura 4-30 °C, para satisfacer las diferentes necesidades de procesamiento de proteínas. Cabe mencionar que UCF.MEMarca registrada La proteasa rTEV tiene una etiqueta 6×His en su extremo N, que puede eliminarse de manera eficiente con resina Ni-NTA, logrando así una purificación precisa de la proteína objetivo.
Visualización del rendimiento
1. Alta eficiencia de escisión: la etiqueta de proteína se escinde más completamente.
Utilizando la proteína de fusión (3 μg) que contiene el UCF.MEMarca registrada Sitio de escisión de la proteasa rTEV como sustrato, UCF.MEMarca registrada Se añadieron 10, 5 y 3 U de proteasa rTEV, respectivamente, y la reacción se llevó a cabo a 30 °C durante 1 h. El efecto de escisión se detectó mediante electroforesis en gel de agarosa. Los resultados mostraron que Yaliviarde UCF.MEMarca registrada La proteasa rTEV pudo escindir el sustrato de manera eficiente cuando la cantidad de entrada fue más de 3 U, con una eficiencia de escisión de >90%.
Figura 3. Verificación de la actividad de escisión de UCF.MEMarca registrada Proteasa rTEV
2. Residuos bajos de ADNg del huésped: reduce eficazmente el riesgo de introducir residuos de sustancias exógenas
Al probar el host (E. coli) residuos de ADNg en diferentes lotes de UCF.MEMarca registrada Proteasa rTEV, los resultados mostraron que el residuo de ADNg del huésped de UCF.MEMarca registrada La proteasa rTEV estaba muy por debajo de <1 copia/U.
Figura 4. Resultados del residuo de ADNg del huésped en UCF.MEMarca registrada Proteasa rTEV
3. Amplias condiciones de aplicación: capaz de satisfacer diferentes requisitos de procesamiento de proteínas.
Al verificar la actividad de escisión de UCF.MEMarca registrada Proteasa rTEV en diferentes condiciones, los resultados mostraron que UCF.MEMarca registrada La proteasa rTEV tuvo una fuerte actividad en condiciones de 4 a 30 °C, lo que pudo satisfacer los diferentes requisitos de aplicación de los clientes.
| Tiempo de reacción (h) | Actividad de escisión a diferentes temperaturas (%) | |||
| 4℃ | 16℃ | 21℃ | 30℃ | |
| 1 | 34 | 58 | 56 | 85 |
| 2 | 58 | 80 | 78 | 90 |
| 3 | 71 | 99 | 99 | 99 |
| 3.5 | 84 | 99 | 99 | 99 |
YaliviarProductos de proteína de corte de etiqueta de fusión recomendados por
| Producto Nombre | Producto norteocre oscuro | |
| TEV Proteasa | UCF.MEMarca registrada Proteasa rTEV | 20427ES |
| Enteroquinasa | Enteroquinasa recombinante | 20395ES |
| Proteasa SUMO | Proteasa SUMO | 20410ES |
| Proteasa 3C | Proteasa 3C | 20409ES |
Referencias:
[1] Parikh I , Cuatrecasas P .Cromatografía de afinidad[J].Vox Sanguinis, 1972, 23(1-2):141-146.DOI:10.1159/000466530.
[2] Paththamperuma C, Page R C. Ensayo de desactivación de fluorescencia para la actividad de la proteasa TEV [J]. Bioquímica analítica, 2022, 659: 114954.