Con el rápido desarrollo de la glicoproteómica y la investigación de fármacos con anticuerpos, la modificación de la glicosilación también ha atraído mucha atención. El contacto entre células y entre células y patógenos se completa principalmente a través de la interacción de azúcares y proteínas, y la glicosilación determina las propiedades de adhesión de los glicoconjugados. En IgG, la glicosilación ligada a N conservada en Asn297 en la región Fc también es crucial para su actividad. Además, algunos anticuerpos también tienen N-glicanos adicionales, que, junto con el sitio conservado en Asn297 en la región Fc, afectan el reconocimiento, la vida media y la respuesta inmunitaria del anticuerpo.
La glicosilación de proteínas es una modificación postraduccional compleja que implica la conexión de cadenas de glicano en sitios específicos de las proteínas. Dependiendo del tipo de cadena de glicano, las glicoproteínas se dividen en glicoproteínas ligadas a N, glicoproteínas ligadas a O, etc.; además, la glicosilación de proteínas también se ve afectada por el tipo de célula huésped y las condiciones de fermentación (como el medio de cultivo, el valor de pH, la temperatura, etc.). Por lo tanto, las glicoproteínas suelen tener heterogeneidad en los patrones de glicosilación, incluidos los sitios de glicosilación, los niveles de glicosilación y la estructura específica de las cadenas de glicano, lo que hace que el análisis de la cadena de glicano y el trabajo de caracterización estructural sean extremadamente desafiantes. Para obtener la máxima cantidad de información estructural de la cadena de glicano, la estrategia principal del análisis de la cadena de glicano es primero liberar las cadenas de glicano de las proteínas y luego realizar un análisis y caracterización detallados. En esta estrategia, un método de desglicosilación eficiente, preciso y estable es crucial.
En la actualidad, los métodos enzimáticos se utilizan ampliamente para la desglicosilación.
Las glicoproteínas se pueden clasificar en glicopéptidos ligados a N y ligados a O según sus tipos de cadenas de glicanos. Para los glicopéptidos ligados a N, las enzimas comúnmente utilizadas incluyen la péptido N-glicosidasa F (PNGasa F), la endoglicosidasa H (Endo H) y la endoglicosidasa S (Endo S). La PNGasa F hidroliza el enlace GlcNAc-Asn y puede eliminar cadenas de glicanos con alto contenido de manosa, complejos e híbridos. La Endo H escinde los enlaces glucosídicos dentro del núcleo de pentasacárido de la cadena de N-glicano. La Endo S escinde específicamente los glicanos ligados a N del núcleo de quitobiosa de la cadena pesada de la IgG nativa.
Figura 1. Sitio de corte de PNGasa F, Endo H y Endo S.
Entre ellos, PNGase F es el método enzimático más eficaz para eliminar casi todos los enlaces N. oligosacáridos en glicoproteínas, que pueden escindir glicoproteínas de oligosacáridos complejos, híbridos y con alto contenido de manosa conectados por asparagina, eliminando específicamente los glicanos unidos a N. El sitio de escisión es: el enlace amida entre la N-acetilglucosamina (GlcNAc) más interna y el residuo de asparagina, mientras que la asparagina de la proteína se convierte después de la hidrólisis enzimática en ácido aspártico.
Cuando la fucosa α1-6 se encuentra en el núcleo de GlcNAc, la PNGasa F también puede cortar; solo cuando la fucosa α1-3 se encuentra en el núcleo de GlcNAc (común en las glicoproteínas de plantas e insectos), la PNGasa F no puede cortar.
Sin embargo, la reacción enzimática convencional de la PNGasa F requiere varias horas para liberar los N-glicanos de los anticuerpos y, debido a la preferencia por la liberación de glicanos, una desglicosilación incompleta puede conducir a resultados sesgados y la distribución de glicanos obtenida puede no representar la composición correcta de los anticuerpos terapéuticos. Por lo tanto, obtener un perfil de N-glicano preciso lo más rápido posible es crucial para el control de la glicosilación durante el proceso de producción de anticuerpos y proteínas de fusión de anticuerpos y otros agentes bioterapéuticos.
PNGase F rápido
Fast PNGase F es un reactivo recombinante optimizado que puede desglicosilar rápidamente y por completo anticuerpos, inmunoglobulinas, proteínas de fusión y otras glicoproteínas en unos pocos minutos. Esta enzima puede eliminar rápidamente y sin preferencia todos los N-glicanos y se puede utilizar directamente para análisis cromatográficos o de espectrometría de masas posteriores. Yeasen Fast PNGase F, N-glicosidasa F (versión rápida) simplifica el proceso experimental, reduciendo el tiempo experimental al tiempo que garantiza la sensibilidad y la repetibilidad.
Características del producto:
Rápido: Desglicosilación completa y rápida en pocos minutos.
Alta pureza: Sin contaminación por proteasas ni glicosidasas, pureza ≥95%.
No selectivo: Eliminar rápidamente y sin preferencia todos los N-glicanos.
Buena compatibilidad: Se utiliza directamente para análisis de cromatografía posterior o espectrometría de masas.
Datos de prueba:
Desglicosilación de proteínas en un solo paso:
- 10 ug de sustrato/100 ug de anticuerpo y ddH2O mezclados hasta un volumen total de 16 uL;
- Añadir 4 μL de tampón Fast PNGase F (5x), volumen final 20 uL;
- Agregue 1 μL de Fast PNGase F.
- Incubar a 50°C durante 10 minutos.
Figura 2. Efecto de escisión enzimática de un solo paso sobre el sustrato de proteína (A) y el anticuerpo (B).
1: Marcador de proteína (Cat#20350ES) 2: Competidor + sustrato o anticuerpo 3: Competidor + sustrato o anticuerpo 4: Yeasen Fast PNGase F 5: Yeasen Fast PNGase F6: Sustrato o anticuerpo 7: Yeasen Fast PNGase F 8: Competidor
Desglicosilación de proteínas en dos pasos:
- 10 ug de sustrato/100 ug de anticuerpo y ddH2O mezclados hasta un volumen total de 16 uL;
- Añadir 4 μL de tampón Fast PNGase F (5x), volumen final 20 uL;
- Incubar a 80°C durante 2 minutos, enfriar a temperatura ambiente.
- Agregue 1 μL de Fast PNGase F.
- Incubar a 50°C durante 10 minutos.
Figura 3. Efecto de escisión enzimática en dos pasos sobre el sustrato proteico (A) y el anticuerpo (B).
1: Marcador de proteína (Cat#20350ES) 2: Competidor + sustrato o anticuerpo 3: Competidor + sustrato o anticuerpo 4: Yeasen Fast PNGase F 5: Yeasen Fast PNGase F6: Sustrato o anticuerpo 7: Yeasen Fast PNGase F 8: Competidor
Conclusión:
- La Yeasen Fast PNGase F tiene la misma o mayor eficiencia de escisión enzimática que los competidores importados en las mismas condiciones de reacción;
- Se recomienda realizar una escisión enzimática en dos pasos para garantizar una mayor eficiencia de escisión enzimática. Algunos anticuerpos (como la N-glicosilación de Fab) requieren un paso de precalentamiento.
para una desglicosilación eficiente.
Además, Yeasen También proporciona PNGasa F regular (Cat#20407ES, actividad específica: 100000 U/mL) y otros tipos de glicosidasas, como Endo H glicosidasa H (Cat#20414ES), Endo S glicosidasa S (Cat#20413ES).
Guía de compra
| Número de producto | 20406ES | 20407ES | 20414ES | 20413ES |
| Nombre del producto | Rápido PNGasa F | PNGasa F | Endo H | Endo S |
| Fuente | Expresión recombinante de levadura | Expresión recombinante de levadura | Expresión recombinante de levadura | E. coli expresión recombinante |
| Actividad específica | No aplicable | 100000 U/ml | 1000000U/ml | 8000 U/mg |
| Sitio de escisión | Casi todos los glicanos ligados a N | Casi todos los glicanos ligados a N | Glicanos con alto contenido de manosa ligados a N | Se escinde dentro de la estructura central del disacárido de la cadena pesada de IgG. |
| Tiempo de digestión | 10 minutos | 1-3 horas | 1-3 horas | 1 hora |
| Glicosilación | Adecuado | Adecuado | Adecuado | Adecuado |
| Estructura de la proteína | Adecuado | Adecuado | Adecuado | Adecuado |
Información de pedidos
| Nombre del producto | Número de producto | Especificación |
| 20406ES20/50 | 20 toneladas/50 toneladas | |
| 20407ES01/02 | 15000 U/75000 U | |
| 20414ES92/97 | 10000 U/50000 U | |
| 20413ES80/90 | 1000 unidades/5 x 1000 unidades |