Cuando se trata de telómeros y protelomerasa En biología, la mente de las personas suele pensar primero en el envejecimiento, un fenómeno natural inevitable. Telómeros es secuencias repetitivas de ADN en los extremos de los cromosomas eucariotas, que llevan la responsabilidad de mantener la integridad de los cromosomas y regular el ciclo de división celular.
Protelomerasa Es una enzima sintetizadora de ADN con transcriptasa inversa que extiende los telómeros. Es una nucleoproteína compuesta de ARN y proteínas. El componente proteico puede catalizar la síntesis de secuencias repetidas de telómeros. con el componente ARN.
Figura 1. Mecanismo de extensión de telómeros mediada por protelomerasa[1]
Protelomerasa Puede reparar y alargar los telómeros, compensar defectos en la replicación del ADN, prevenir la pérdida de telómeros durante la división celular y aumentar el número de divisiones celulares. En 2009, el Premio Nobel de Fisiología o Medicina fue otorgado a Elizabeth H. Blackburn, Carol W. Greider y Jack W. Szostak por sus destacadas contribuciones al revelar el papel crucial de los telómeros y la proteomerasa. en la función celular y el envejecimiento.
Hoy quiero presentarles una protelomerasa única: la proprotelomerasa TelN. Protelomerasa TelN proviene del bacteriófago N15 y es un componente del sistema de replicación N15, participando en la generación de ADN profágico lineal. A diferencia de la Protelomerasa En eucariotas, TelN es una enzima proteica pura sin ningún componente de ARN. Tiene capacidad de escisión-ligación. actividad y deja un extremo cerrado covalentemente en el sitio de escisión después de cortar el ADN de doble cadena (dsDNA).
Figura 2. Protelomerasa TelN Sitio de escisión
Protelomerasa TelN Mecanismo de acción
El sitio de reconocimiento de la protelomerasa TelN es una secuencia palíndromo de 56 pb de longitud, con telR y telL en ambos lados. La posición central de la secuencia diana también es una secuencia palíndromo telO. TelN Protelomerasa se corta dentro de la secuencia telO y forma una estructura de horquilla cerrada covalentemente en los dos extremos de corte. El extremo del ADN después de la digestión todavía está compuesto por telR y telL, lo que se conoce como hueso de perrito ADN (dbDNA).
Figura 3. Protelomerasa mecanismo de escisión en el sitio TelN[2]
Debido a la actividad especial de escisión-ligación enzimática de la proteomerasa TelN, el ADN plasmídico circular se puede convertir en moléculas lineales cerradas covalentemente con forma de mancuerna a través de una reacción enzimática de un solo paso. En comparación con las moléculas de ADN lineal abierto, el ADN lineal cerrado tiene un nivel de expresión de proteínas más alto en las células, lo que es muy adecuado para construir mini ADN lineal de extremo cerrado con alta estabilidad y mínima secuencia extraña. El ADN plasmídico juega un papel vital como elemento central de la vacuna de ARNm, la vacuna de ADN y la terapia génica celular. El método tradicional de producción de plásmidos implica la fermentación con E. coli y la amplificación en múltiples etapas, y el riesgo incontrolable en el proceso de fermentación limita el rendimiento de plásmidos de alta calidad, lo que se convierte en la clave para limitar la capacidad de producción de vacunas. La empresa Touchlight en el Reino Unido ha lanzado una innovadora tecnología dbDNA. Esta tecnología altera el método tradicional de fermentación bacteriana para la preparación de ADN plasmídico y, en lugar de utilizar la síntesis enzimática de ADN in vitro, también se emplea la actividad especial de escisión-ligación enzimática de la proteomerasa TelN para generar mini ADN lineal de extremo cerrado en el método anterior.
Aplicación de la protelomerasa TelN en la síntesis enzimática del ADN
El método enzimático in vitro de ADN basado en la ADN polimerasa phi29 y la proteomerasa TelN puede evitar muchos riesgos incontrolables en el proceso de fermentación biológica, y el método enzimático in vitro puede sintetizar ADN con gran velocidad y alto rendimiento. El ADN sintetizado se puede utilizar en muchas tecnologías emergentes, como la vacuna de ARNm, la vacuna de ADN, el vector de terapia génica y la edición génica.
Figura 4. Diagrama de flujo de la síntesis enzimática del ADN[3]
Proceso de síntesis enzimática del ADN
- Desnaturalización de plantillas
La plantilla de ADN plasmídico circular se convierte en dos ADN circulares monocatenarios mediante un proceso de desnaturalización.
- Amplificación por círculo rodante
La amplificación por círculo rodante se llevó a cabo utilizando la ADN polimerasa Phi29 y ADN circular monocatenario para generar ADN concatemérico bicatenario lineal largo con intervalos de secuencia de reconocimiento de protelomerasa.
- Corte y cierre covalente
La protelomerasa TelN reconoce el telRL en el ADN de los complejos teloméricos y realiza actividades de escisión-ligación para generar monómeros de ADN lineales conectados covalentemente.
- Eliminación del ADN de la estructura principal bacteriana
Las endonucleasas de restricción o exonucleasas degradan el ADN del esqueleto bacteriano con una estructura abierta en el extremo para obtener ADN que contiene solo los elementos de expresión del gen objetivo. La tecnología de síntesis enzimática de ADN evita la fermentación biológica y puede lograr rápidamente la síntesis de ADN plasmídico a nivel de GMP, solucionando las limitaciones de capacidad de producción en los campos de la terapia génica y las vacunas de ARNm. Tiene un enorme potencial para la industrialización. Para promover el desarrollo de la tecnología de síntesis enzimática de ADN, YEASEN Biology puede proporcionar materiales enzimáticos básicos para la síntesis enzimática de ADN, como la ADN polimerasa phi29 (14404ES) y la protelomerasa TelN (14540ES), para ayudar en la investigación y producción de la tecnología de síntesis enzimática de ADN.
PAGpresentación de desempeño De YEASEN Protelomerasa TelN
- El rendimiento de la ligadura-escisión es excelente, equivalente al de las marcas importadas.
Utilizando un plásmido superenrollado que contiene el sitio de reconocimiento de la proteomerasa TelN como plantilla, se añadió la enzima de adición de gradiente (0,078-5 U) de YEASEN y la marca A. 0,5 μg de plásmido superenrollado se convirtieron en ADN bicatenario lineal cerrado (dsADN). Se utilizó electroforesis en gel para detectar la eficiencia de conversión y los resultados mostraron que la actividad de escisión y ligadura de la proteomerasa TelN de YEASEN fue equivalente a la de la marca A.
Figura 5. Detección de la actividad de escisión de la proteomerasa de TelN M:Marker, C: control de plásmido superenrollado
- La integridad del cierre del dsADN lineal > 90%
Utilizando el plásmido superenrollado que contiene el sitio de reconocimiento de la proteomerasa TelN como plantilla, añadiendo la proteomerasa TelN de YEASEN y la marca A, convirtiendo 0,5 μg de plásmido superenrollado en dsADN lineal cerrado y añadiendo la exonucleasa T5 para detectar su integridad final a través del grado de degradación de la banda. Los resultados mostraron que la integridad del cierre final del dsADN generada por la proteomerasa TleN de YEASEN fue > 90%, lo que fue equivalente a la de la marca A.
Figura 6. Prueba de integridad del cierre del extremo de la proteomerasa TelN. C1: plásmido que contiene el sitio de reconocimiento de TelN, sin proteomerasa TelN; C2: plásmido que contiene el sitio de reconocimiento de TelN, proteomerasa TelN, sin exonucleasa T5; Plásmido: plásmido que contiene el sitio de reconocimiento de TelN.
Productos relacionados de Síntesis enzimática del ADN
| Clasificación de productos | Nombre del producto | N.º de catálogo |
| Protelomerasa | 14540ES | |
| ADN polimerasa Phi29 | 14404ES | |
| Exonucleasa | Exonucleasa III | 14525ES |
| 14538ES | ||
| dNTP | 10125ES |
Rreferencias
[1] Giardini MA, Segatto M, da Silva MS, Nunes VS, Cano MI. Telómero y protelomerasa biología. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;125:1-40.
[2] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. El mini ADN lineal cerrado generado por la enzima de corte y unión procariota TelN es funcional en células de mamíferos. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654.
[3] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. El mini ADN lineal cerrado generado por la enzima de corte y unión procariota TelN es funcional en células de mamíferos. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654. doi:10.1007/s00109-002-0362-2.