- Fondo
Los datos resumidos en este informe fueron realizados por Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. para MycAwayMT. Kit de detección de micoplasma mediante qPCR en tiempo real (2G) producto.
Los datos resumidos son solo para referencia del usuario, y el usuario debe verificar el método de micoplasma utilizando sus propias muestras para confirmar que el método puede cumplir con los requisitos del usuario. Se recomienda a todos los laboratorios que utilicen este kit que verifiquen los siguientes parámetros: límite de detección, especificidad y robustez.
Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. puede proporcionar el informe de calificación detallado para este kit. Si el usuario utiliza este informe, solo se debe verificar la idoneidad (que incluye el límite de detección y la especificidad).
Contenido de validación:
| Actuación | Parámetros de validación | Resultados de la validación |
| Límite de detección | Límite de detección de cepas de micoplasma | Límite de detección para 10 tipos de micoplasma farmacopéico: 10 UFC/mL, cada uno analizado 24 veces con una tasa de detección de ≥95%. |
| Especificidad | Interferencia de matriz de muestra | Se analizaron 9 matrices de muestras y soluciones de dilución de ADN diferentes y no se detectó micoplasma. |
| Reactividad cruzada | Se analizaron 14 cepas y 6 células de ingeniería comúnmente utilizadas en productos biofarmacéuticos y no se detectó ningún micoplasma. | |
| Durabilidad | Estabilidad a la congelación y descongelación | Puede soportar 20 ciclos repetidos de congelación y descongelación sin afectar el rendimiento del kit. |
| Estabilidad de aceleración térmica | No se ve afectado en condiciones de 37°C durante 14 días y 4°C durante 30 días. | |
| Compatibilidad de instrumentos | Compatible con ABI7500, ABI QuantStudio™5, Bio-Rad CFX96 y Roche LightCycler®480. | |
| Cobertura | Cobertura de los tipos de ADN de micoplasma | La comparación de bases de datos utilizando secuencias de ARNr 16S de micoplasma cubre 183 especies dentro de la clase Mollicutes. |
- Materiales y métodos experimentales
2.1 Mi cAwayMT. Kit de detección de qPCR en tiempo real de micoplasma (2G), proveedor: Yeasen, n.º de cat.: 40619ES60.
2.2 MolPureMT. Kit de preparación de muestras de ADN residual magnético, proveedor: Yeasen, n.º de cat.: 18461ES60.
2.3 Los estándares de sensibilidad de Mycoplasma se adquieren de Minerva Biolabs (MB), cuyas cepas provienen de la Colección Nacional de Cultivos Tipo (NCTC). Los estándares de sensibilidad son micoplasmas inactivados y se utilizan para la verificación metodológica del método de amplificación de ácidos nucleicos (método qPCR/PCR) para la detección de micoplasmas. Se adquieren un total de 10 tipos de micoplasmas que incluyen los requisitos de EP 2.6.7 y JP G3. La información de los estándares es la siguiente:
| Proveedor | Gato Nro. | N.º NCTC | CCC-AT No. | Nombre del material |
| Laboratorios Minerva Biolabs (MB) | 102-1003 | 10129 | 23838 | 10 UFC™ Estándar de sensibilidad Micoplasma arginini |
| 102-2003 | 10112 | 23714 | 10 UFC™ Estándar de sensibilidad Micoplasma oral | |
| 102-3003 | 10115 | 19610 | 10 UFC™ Estándar de sensibilidad Micoplasma gallisepticum | |
| 102-4003 | 10119 | 15531 | 10 UFC™ Estándar de sensibilidad Pneumonia por micoplasma | |
| 102-5003 | 10124 | 25204 | 10 UFC™ Estándar de sensibilidad Micoplasma synoviae (Micoplasma sinovial) | |
| 102-6003 | 10117 | 19989 | 10 UFC™ Estándar de sensibilidad Micoplasma fermentans | |
| 102-7003 | 10130 | 17981 | 10 UFC™ Estándar de sensibilidad Micoplasma hyorhinis | |
| 102-8003 | 10116 | 23206 | 10 UFC™ Estándar de sensibilidad Acholeplasma laidlawii (Acholeplasma laylawii) | |
| 102-9003 | 10164 | 27556 | 10 UFC™ Estándar de sensibilidad Espiroplasma citri | |
| 102-11003 | 10113 | 23064 | 10 UFC™ Estándar de sensibilidad Mycoplasma salivarium |
2.4 Datos originales: la versión electrónica fue registrada en el 'Informe Experimental' el subarchivo del archivo padre 'MycAwayMT. Kit de detección de qPCR en tiempo real de micoplasma (2G)'.
2.5 Métodos: Los materiales y métodos de operación utilizados para el experimento fueron básicamente producidos o establecidos por Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., los cuales fueron evaluados y verificados durante mucho tiempo, el desarrollo y fabricación del kit siguieron el sistema ISO 13485.
- Contenidos y resultados de la calificación
3.1 Límite de detección (LOD)
La extracción de ácidos nucleicos, así como la detección de la cepa estándar de Mycoplasma de 10 UFC/ml, se realizó de acuerdo con las instrucciones para la cepa estándar, así como las instrucciones para el kit de extracción y detección. Se obtuvieron un total de 24 ensayos para la cepa estándar de Mycoplasma de 10 UFC/ml. Las muestras NCS (muestra de control negativo) y NTC (muestra de control sin plantilla) se analizaron simultáneamente en cada experimento.
Los resultados mostraron que los resultados de NCS y NTC fueron satisfactorios y las 24 muestras de 10 UFC/mL dieron positivo, cumpliendo con el requisito de tener al menos 23 resultados positivos de 24 pruebas.
| No. | Nombre del material | Concentración de líquido bacteriano |
| 1 | Micoplasma arginini | 10 UFC/ml |
| 2 | Micoplasma oral | 10 UFC/ml |
| 3 | Micoplasma gallisepticum | 10 UFC/ml |
| 4 | Pneumonia por micoplasma | 10 UFC/ml |
| 5 | Micoplasma synoviae (Micoplasma sinovial) | 10 UFC/ml |
| 6 | Micoplasma fermentans | 10 UFC/ml |
| 7 | Micoplasma hyorhinis | 10 UFC/ml |
| 8 | Acoleplasma laylawii (escuchar) | 10 UFC/ml |
| 9 | Espiroplasma citri | 10 UFC/ml |
| 10 | Mycoplasma salivarium | 10 UFC/ml |
Tabla 1 Información sobre cepas validadas
| 10 UFC/ml | Experimento 1 | Experimento 2 | Experimento 3 |
| Tasa de detección | 8/8 | 8/8 | 8/8 |
| Total | 24/24 | ||
Tabla 2 Resultados del límite de detección
3.2 Especificidad
3.2.1 Rango de pruebas de micoplasma
Las secuencias de sondas de iniciadores del kit se compararon con el genoma del ARNr 16S en la base de datos. A través del análisis bioinformático, se obtuvo que el MycAwayMT. El kit de detección qPCR de Mycoplasma (método de sonda) de NextSense Biologicals puede cubrir al menos 183 especies de Zooxanthellae, incluidas 120 Mycoplasma, 9 Ureaplasma, 33 Spiroplasma y 7 Cholestrongyla, etc.
3.2.2 Interferencia de la matriz de muestra
9 sustratos (MEM de Dulbecco, medio F-10 de Ham, medio M-199, medio F-12K de Ham de Kaighn, medio RPMI-1640, 5A de McCoy, F-12K de Ham de Kaighn+1,0 mM/L de glutamina, L-15 LEIBOVITZ MEDTA +2.Se utilizan 0,5 mM de L-glutamina, medio estándar DMEM con bajo contenido de glucosa) como muestras para verificar la interferencia de la matriz de muestra; los resultados mostraron que el medio no interfiere con los reactivos del kit.
3.2.3 Rango de detección de Flexibacteria
Se requiere la extracción y detección de micoplasma inactivado (Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hyorhinis, Acholeplasma laidlawii, Spiroplasma citri, Mycoplasma salivarium) a 10 UFC/mL junto con las pruebas de muestras NCS y NTC.
Los resultados mostraron que no se detectaron NCS ni NTC y los resultados fueron negativos; se detectaron las 10 especies de micoplasma y los resultados fueron positivos.
3.2.4 Reacción cruzada
Para la detección de micoplasma se utilizaron 14 cepas no flexibacterianas, entre ellas Clostridium (Clostridium perfringens, Clostridium acetobutylicum), Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus), Streptococcus (Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae), una serie de otros microorganismos comunes de bacilo-coco-hongo (Staphylococcus epidermidis, Acinetobacter baumannii, Enterobacter aerogenes, Micrococcus garciniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonalbacterium leucocephala, Salmonella enterica enteritidis subsp. enterica, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis y Bacillus sp. Bacillus cereus, Bacillus cereus) y seis células modificadas genéticamente (HEK293, 293T, Vero, CHO, E. coli, SF9).MT. Kit de preprocesamiento de muestras de ADN residual (frascos) y MycAway con método de perlas magnéticasMT. Kit de detección de qPCR de micoplasma (método de sonda) (2G), y cada experimento se realizó simultáneamente con las pruebas de muestras PCS, NCS y NTC.
Los resultados mostraron que los resultados de PCS, NCS y NTC fueron satisfactorios; las muestras de prueba fueron negativas y no se produjo reactividad cruzada.
3.3 Robustez
3.3.1 Estabilidad a la congelación y descongelación
El kit de prueba de Mycoplasma se sometió a experimentos de congelación y descongelación en condiciones de -25 ℃ ~ -15 ℃, y los resultados mostraron que el kit pudo soportar 20 congelaciones y descongelaciones repetidas, y su rendimiento no se vio afectado.
3.3.2 Estabilidad acelerada
El kit de detección de micoplasma se aceleró térmicamente a 37 ℃ durante 14 días y a 4 ℃ durante 30 días, respectivamente, y los resultados mostraron que el rendimiento del producto no se vio afectado.
3.3.3 Aplicabilidad del instrumento
Para el kit de detección de micoplasma, se utilizaron diferentes concentraciones de control positivo y ADN de Mycoplasma pneumoniae en el kit como muestras a analizar, y los experimentos se realizaron en cuatro marcas y modelos diferentes, a saber, Thermo Scientific ABI7500, Thermo Scientific ABI Q5, Shanghai Hongshi SLAN-96S y Roche LightCycler®480, respectivamente.Los experimentos se realizaron en los instrumentos qPCR de cuatro marcas y modelos diferentes, Shanghai Hongshi SLAN-96S y Roche LightCycler®480.
Los resultados mostraron que las muestras a analizar fueron detectadas en instrumentos qPCR de modelos de diferentes fabricantes y los resultados del control negativo fueron calificados, y el rendimiento del kit no se vio afectado.
- 4.Referencia
4.1 Método de examen de micoplasma <3301>. Farmacopea china, Parte III [S]. Pekín: China Science and Technology Press, 2020: 542-543.
4.2 Directrices para la validación de métodos analíticos <9101>. Farmacopea china, Parte III [S]. Pekín: China Science and Technology Press, 2020: 682.
4.3 Directrices para la validación de métodos alternativos de análisis microbiológicos de productos farmacéuticos <9201>. Farmacopea china, Parte III [S]. Pekín: China Science and Technology Press, 2020: 684.
4.4 Micoplasmas. Farmacopea Europea[S]. 10.ª edición, 2020: Sección 2.6.7, 194-199.
4.5 Pruebas de detección de micoplasma para sustratos celulares utilizados en la producción de productos biotecnológicos/biológicos <G3-14-170>. Farmacopea Japonesa[S]. 18.ª edición, 2021: 2678-2682.
4.6 Erica J. Fratz-Berilla, Phillip Angart, Ryan J. Graham, et al. Impactos en los atributos de calidad del producto de los anticuerpos monoclonales producidos en cultivos de biorreactores de células CHO durante eventos de contaminación intencional por micoplasma. Biotecnología y bioingeniería. 2020;117(9): 2802-2815.
4.7 Dmitriy V. Volokhov, Laurie J Graham, Kurt A Brorson, Vladimir E Chizhikov. Pruebas de sustratos celulares y productos biológicos para detectar micoplasma: revisión de técnicas alternativas no microbiológicas. Mol Cell Probes. Abril-junio de 2011;25(2-3):69-77.
4.8 AL Ingebritson, CP Gibbs, C. Tong, GB Srinivas. Un método de detección por PCR para evaluar la contaminación por micoplasma de vacunas veterinarias y productos biológicos. Lett in Applied Microbiology. Febrero de 2015;60(2):174-180.
Información de pedidos
| Descripción | Número de pieza |
| Kit de preparación de muestras de ADN residual magnético MolPure® | 18461ES |
| Kit de detección de qPCR de micoplasma MycAway™ (2G) | 40619ES |