Chorro Kit de detección de residuos de ADN en células huésped (3GRAMO)
Resumen de calificación (Cat. No.: 41332ES60)
- Fondo
Los datos resumidos en este informe fueron realizados por Yeasen Biotechnology para CHO Kit de detección de residuos de ADN de células huésped (3G). Los datos resumidos son solo para referencia del usuario, y el usuario debe verificar los residuos de ADN de células huésped. Método de ADN que utiliza sus propias muestras para confirmar que el método puede cumplir con los requisitos del usuario. Se recomienda a todos los laboratorios que utilicen este kit que verifiquen los siguientes parámetros: linealidad, rango, exactitud, precisión, límite de cuantificación, especificidad y robustez.
Yeasen Biotechnology puede proporcionar el informe de calificación detallado para este kit. Si el usuario utiliza este informe, solo se evaluará la idoneidad (que incluye precisión, Exactitud y especificidad) debe verificarse.
- Materiales y métodos experimentales
2.1 Chorro Kit de detección de residuos de ADN de células huésped (3G), proveedor: Yeasen, n.º de cat.: 41332ES60.
2.2 Kit de preparación de muestras de ADN residual magnético MolPure, proveedor: Yeasen, n.º de cat.: 18461ES60.
2.3 Datos originales: la versión electrónica se registró en el 'Informe del Experimento' el subarchivo del archivo padre Chorro Kit de detección de residuos de ADN en células huésped (3G).
2.4 Métodos: Los materiales y métodos de operación utilizados para el experimento fueron básicamente producidos o establecidos por Yeasen Biotechnology, los cuales fueron evaluados y verificados durante mucho tiempo, el desarrollo y fabricación del kit siguieron el sistema ISO 13485.
- Contenidos y resultados de la calificación
3.1 Rango de detección
El rango lineal del kit fue de 3 fg/μL~300 pg/μL con R2=1, y la eficiencia de amplificación fue del 99,09% con CV<15% para cada ensayo de concentración.
Figura 1 Curva estándar de qPCR de ADN CHO (3G)
3.2 Precisión
3.2.1 Rrecuperación ecológica
3.2.1.1 Experimento de recuperación de adición de muestra en blanco
Muestras de CHO Estándares de ADN en concentraciones altas y bajas: 30 pg/μl, 300 Se prepararon fg/μL y 3 fg/μL, respectivamente, y se analizaron después de la extracción utilizando el kit de pretratamiento de muestras de ADN residual con método de perlas magnéticas (3 Se realizaron réplicas de extracción para cada muestra y 3 réplicas de ensayo para cada extracción) y se analizaron las recuperaciones de muestra y los CV.
Para diferentes concentraciones de muestras de ADN, las recuperaciones variaron entre el 70% y el 130%, y los CV fueron todos <20%.
| Tipo de muestra | Concentración teórica | Extracto 1 media | Extracto 2 media | Extracto 3 media | Concentración media | CV | Recuperación |
| Muestra en blanco | / | / | / |
| / | / | / |
| Muestra de recuperación 1 | 30 pg/μL | 27.07 | 27.51 | 28.27 | 27.62 | 2,20% | 92,06% |
| Muestra de recuperación 2 | 300 fg/μL | 285,53 | 301.25 | 295,71 | 294,16 | 2,71% | 98,05% |
| Muestra de recuperación 3 | 3 fg/μl | 3,50 | 3.54 | 3.31 | 3.45 | 3,56% | 115,00% |
Tabla 1 Recuperación de la adición de muestra en blanco
3.2.1.2 Experimento de recuperación de adición de muestra simulada
Se extrajeron muestras de la misma concentración (300 fg/μL de ADN de CHO) (se realizaron 3 réplicas de extracción para cada muestra y 3 réplicas de ensayo para cada extracción) con 5 soluciones de fondo diferentes (alto contenido de proteínas, alto contenido de ácido nucleico, pH alto y bajo, alto contenido de sal) y se analizaron las recuperaciones de muestras y los CV.
Las recuperaciones de muestras de ADN para diferentes soluciones de fondo variaron entre el 70% y el 130%, con todos los CV <20%.
| Tipo de muestra | Concentración teórica | Extracto 1 media | Extracto 2 media | Extracto 3 media | Concentración media | CV | Recuperación |
| Muestra básica | / | / | / |
| / | / | / |
| Alto contenido de proteínas | 300 fg/μL | 302.29 | 332,86 | 342,76 | 325,97 | 6,47% | 108,66% |
| Alto nivel de ácido nuclear | 284,47 | 290,66 | 308,76 | 294,63 | 4,28% | 98,21% | |
| Alto contenido de sal | 272,96 | 286,25 | 312,91 | 290,71 | 7,00% | 96.90% | |
| pH alto | 296.04 | 320,58 | 324,56 | 313,72 | 4,92% | 104,57% | |
| pH bajo | 314,77 | 327,89 | 340,26 | 327,64 | 3,89% | 109,21% |
Tabla 2 Recuperación básica de la adición de muestras
3.3 Precisión
3.3.1 Repetibilidad
Repita el ensayo 10 veces para los estándares de ADN CHO a una concentración de 3 fg/μL con un CV <15%.
| Repeticiones | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Significar | % de CV |
| Valor de detección (fg/μL) | 3.13 | 3.26 | 2,89 | 3.16 | 2,95 | 2.87 | 2.88 | 2,75 | 2.87 | 3.15 | 2,99 | 5,65% |
Tabla 3 Resultados de repetibilidad
3.3.2 Precisión intermedia
Tres experimentadores probaron de forma independiente muestras estándar de ADN de CHO en concentraciones altas y bajas: 300 pg/μL, 3 pg/μL y 3 fg/μL, y se realizaron tres réplicas para cada concentración, y los CV de los nueve datos obtenidos fueron <15%.
| Exp |
Concentración real Concentración teórica | ADN CHO (3G) | ||
| 300 pg/ul | 3 pg/ul | 3 fg/ul | ||
| Experiencia 1 | Determinación 1 | 302.63 | 2,97 | 3.40 |
| Determinación 2 | 294,54 | 3.01 | 3.14 | |
| Determinación 3 | 287,67 | 2,99 | 3.01 | |
| Exp2 | Determinación 4 | 292.27 | 2,92 | 3.47 |
| Determinación 5 | 299,61 | 2,90 | 2.82 | |
| Determinación 6 | 305,73 | 2.93 | 2,90 | |
| Exp. 3 | Determinación 7 | 301.06 | 3.17 | 3.15 |
| Determinación 8 | 299,17 | 3.00 | 3.21 | |
| Determinación 9 | 290,66 | 2,90 | 3.05 | |
| / | Significar | 297.04 | 2,98 | 3.13 |
| / | % de CV | 2.03 | 2.80 | 6.85 |
Tabla 4 Resultados de precisión intermedia
3.4 Especificidad
Se evaluó la interferencia del ADN genómico celular comúnmente utilizado en la producción de productos biológicos con reactivos de detección de ADN CHO, y el grupo de interferencia se superpuso con el grupo de control y no se observó interferencia (la figura a continuación muestra, en orden, los datos de interferencia del ADN genómico de ratón, MDCK, HEK293 y E. coli con reactivos de detección de ADN CHO).
Figura 2 Resultados del experimento de interferencia
3.5 Límite de cuantificación
Se detectó ADN de CHO a 3 fg/μL, 1 fg/μL, 0,5 fg/μL, 0,3 fg/uL y 0,1 fg/μL, con 10 réplicas para cada concentración. Los resultados mostraron que el CV fue <20% a concentraciones de 0,3 fg/μL y superiores. Es decir, el límite de cuantificación del kit de detección de residuos de ADN de células huésped de CHO (3G) fue de 0,3 fg/μL.
|
Repeticiones Elemento de prueba | ADN de CHO (3G) (fg/μL) | |
| Cantidad | Porcentaje de recálculo | |
| 1 | 0,28 | 93,33% |
| 2 | 0,26 | 86,67% |
| 3 | 0,32 | 106,67% |
| 4 | 0,30 | 100,00% |
| 5 | 0,33 | 110,00% |
| 6 | 0,23 | 76,67% |
| 7 | 0,29 | 96,67% |
| 8 | 0,37 | 123,33% |
| 9 | 0,31 | 103.33% |
| 10 | 0,28 | 93,33% |
| Significar | 0,30 | / |
| % de CV | 13,09% | / |
Figura 3. Resultado de la prueba qPCR de ADN de CHO (3G)
3.6 Límite de detección
Se detectó ADN de CHO a 0,3 fg/μL, 0,1 fg/μL, 0,05 fg/μL y 0,01 fg/μL, con 20 réplicas para cada concentración. Los resultados mostraron que la tasa de detección fue ≥19 (es decir, tasa de detección ≥95%) en 20 pocillos de réplica a concentraciones de 0,05 fg/μL y superiores. Es decir, el límite de detección del kit de detección de residuos de ADN de células huésped de CHO (3G) fue de 0,05 fg/μL.
Figura 4. Resultado de la prueba qPCR de ADN CHO (3G)
3.7 Robustez
Este kit ha sido probado y es adecuado, entre otros, para los siguientes instrumentos:
| Proveedor | Modelos de instrumentos | Eficiencias de amplificación | R2 | Límite de cuantificación | CV | Límite de detección | Tasa de detección |
| Termo | ABI 7500 | 99,69% | 1 | 0,3 fg/μl | 12,40% | 0,05 fg/μl | 95,65% |
| Termo | Estudio cuantitativo ABI5 | 99,26% | 1 | 0,3 fg/μl | 15,30% | 0,05 fg/μl | 100,00% |
| Roche | Ciclador de luz 480 | 2,05% | 0,978 | 0,3 fg/μl | / | 0,05 fg/μl | / |
| Hongos de Shanghái | SLAN | 101,14% | 0,999 | 0,3 fg/μl | 14,41% | 0,05 fg/μl | 95,65% |
Tabla 5 Resultados de la prueba de idoneidad del instrumento
3.8 Estabilidad
3.8.1 Estabilidad a la congelación y descongelación
El kit de detección de residuos de ADN de células huésped CHO (3G) se probó mediante congelación y descongelación repetidas 10 veces y el rendimiento del kit no se vio afectado.
|
Indicadores de prueba Tiempos de congelación y descongelación | Parámetro | Tiempo T0 | Congelar y descongelar 10 veces |
| Parámetro de curva estándar | Eficiencias de amplificación | 95,70% | 98,62% |
| R2 | 1 | 1 | |
| Límite de cuantificación (0,3 fg/μL) | CV | 15,31% | 17,16% |
| Límite de detección (0,05 fg/μL) | Tasa de detección | 95,65% | 100% |
Tabla 6 Análisis de los resultados de estabilidad de congelación y descongelación
3.7.2 Estabilidad acelerada
El kit de detección de residuos de ADN de células huésped CHO (3G) se almacenó a una temperatura de entre 2 y 8 °C durante 30 días y a 37 °C durante 14 días, respectivamente. El rendimiento del kit no se vio afectado.
|
Indicadores de prueba Temperatura y tiempo de aceleración | Parámetro | Experimento 1 | Experimento 2 | ||
| Tiempo T0 | 2~8℃ 30 Días | Tiempo T0 | 37℃ 14 días | ||
| Parámetro de curva estándar | Eficiencias de amplificación | 100,53% | 102,61% | 101,76% | 101,84% |
| R2 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| Límite de cuantificación (0,3 fg/μL) | CV | 17,16% | 12,63% | 16,27% | 12.49 |
| Límite de detección (0,05 fg/μL) | Tasa de detección | 95,65% | 100% | 95,57% | 100% |
Tabla 7 Análisis de resultados de estabilidad acelerada
3.9 Límite de espacio en blanco
3.9.1 Sin control de plantilla (NTC)
El control sin plantilla (NTC) fue la dilución de ADN con 96 repeticiones para realizar el ensayo cuantitativo de qPCR, todos los valores de CT por encima de los 96 pocillos replicados analizados fueron >40.
Figura 5 Resultados del experimento NTC
3.9.2 Muestra de control de extracción negativa (NCS)
La muestra de control de extracción negativa (NCS) fue la dilución de ADN, y primero se extrajo mediante un pretratamiento de la muestra, luego se realizó qPCR, todos los valores de CT por encima de los 48 pocillos replicados probados fueron >40.
Figura 6 CN resultados del experimento
- 4.Referencia
4.1 Comisión de la Farmacopea China (ChPC). Farmacopea de la República Popular China (Vol. III) [S]. Pekín: China Medical Science and Technology Press, págs. 542-543, 2020.
4.2 NMPA, 2007: Principios generales para la revisión técnica de la validación de métodos analíticos para el control de calidad de productos biológicos.
4.3 ICH(2022)《Validación de métodos analíticos Q2》, versión borrador.
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